Laboratorio Práctico
Bioq. Luciana Suárez
luciana.suarez@wiener-lab.com
Marketing Corporativo – Wiener lab. – Rosario – Argentina 

Los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) infectan a los seres humanos principalmente a través de la picadura de artrópodos hematófagos, por ejemplo, mosquitos, garrapatas, entre otros. Hay más de 100 arbovirus que causan infección y enfermedad en los seres humanos. Estas infecciones pueden ser desde asintomáticas hasta poner en riesgo la vida. Estos virus constituyen un grupo amplio de varias familias y géneros, siendo los más importantes en las Américas, los flavivirus (familia Flaviviridae), como los virus del dengue (DENV), del Zika (ZIKV), de la fiebre amarilla (YFV), del Nilo occidental (WNV, por su sigla en inglés) y de la encefalitis de San Luis (SLEV, por su sigla en inglés). También son frecuentes los alfavirus (familia Togaviridae), entre los que se encuentran los virus del chikunguña (CHIKV), Mayaro (MAYV) y los de las encefalitis equinas, y el virus Oropouche (OROV), del género Orthobunyavirus (familia Peribunyaviridae). En este artículo nos centraremos en el DENV. 

En las Américas, el vector principal responsable de la trasmisión urbana del DENV es el mosquito Aedes aegypti y, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), actualmente cerca de 500 millones de personas viven en riesgo de contraer el dengue. En esta región el número de casos de dengue se ha incrementado en las últimas cuatro décadas, pasando de 1,5 millones de casos acumulados en la década del 1980-1989, a 16,2 millones en la década del 2010-2019. Estas cifras siguen en aumento, ya que, de acuerdo con el último reporte de la OMS, hasta la semana epidemiológica 28 (julio 2024) se reportó un aumento de más del 220% de casos con respecto al mismo período del año anterior. Debido a que entre el 65% y 80% de las infecciones son subclínicas, se estima que los números reales de casos son mayores. Los cuatro serotipos del DENV circulan a lo largo del continente y en algunos países circulan simultáneamente, y con esto el aumento de riesgo de las personas de desarrollar dengue grave (0,2% de los casos), y posiblemente mortal (0,05% de los casos), si ocurre una infección por dos serotipos diferentes. 

Todos los años se registran brotes de infecciones por DENV y se observa que se incorporan más zonas con dengue autóctono. Las causas por lo que esto ocurre son por cambio climático, movimiento poblacional de viajes y migraciones y problemas socioeconómicos con urbanizaciones desorganizadas. Además, se observa que cada vez son más cortos los tiempos inter epidémicos. 

Diagnóstico 

Todo paciente con sospecha de infección por DENV debe ser tratado y monitoreado los signos de alarma, por lo menos hasta obtener el diagnóstico por laboratorio, el cual confirma o descarta la infección. Por esta razón es importante contar con una metodología rápida con alta sensibilidad y especificidad. 

En áreas sin circulación autóctona del virus todo caso sospechoso se debe confirmar por laboratorio. Para regiones donde ya está confirmado el brote o en presencia de una epidemia se diagnostican por laboratorio los casos graves, es decir personas internadas y/o con comorbilidades que presenten signos de alarma, como por ejemplo aumento del 20% del hematocrito, disminución del recuento de plaquetas, dolor abdominal intenso, sangrado de mucosas, dificultad respiratoria entre otros, y/o fallecidos. Además de estos casos, se debe realizar diagnóstico por laboratorio a un porcentaje de muestras para el estudio de duración temporal del brote, a un porcentaje de muestras para evaluación epidemiológica del serotipo circulante y cuando se produce una expansión a nuevas áreas. 

La definición del serotipo (DENV-1, DENV-2, DENV-3 o DENV-4) tiene solamente objetivos epidemiológicos, no está establecida la relación entre serotipo y gravedad en las manifestaciones clínica, mayor o menor incidencia en la tasa de contagio o tratamiento diferencial. Todos los serotipos generan anticuerpos serotipos específicos de por vida y una inmunidad transitoria contra los otros serotipos. 

Muestras 

Los tipos de muestras son suero, plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR) en caso de afectación neurológica y tejido en caso de fallecido. Ocasionalmente se puede utilizar orina. Las muestras se deben mantener refrigeradas (2-8 °C) y si es necesario conservarla por más de 48 hs. se recomienda congelar (-10 a -20 °C), pero evitar ciclos de congelamiento y descongelamiento. Si debe ser transportada a un centro de referencia es necesario que sea en triple envase. Las condiciones de bioseguridad son de clase II, no solo por el dengue y su posible trasmisión por aerosoles, sino también por las infecciones de diagnóstico diferencial. Por lo tanto, se recomienda trabajar en cabinas de bioseguridad la extracción de ARN y pruebas serológicas. Las muestras obtenidas de la extracción de ARN se consideran material no infeccioso, al igual que las muestras de tejido. 

Metodología de elección 

La metodología de elección que se debe utilizar para el diagnóstico por laboratorio de dengue depende del tiempo de evolución del paciente. Por lo tanto, es muy importante contar con la fecha de inicio de síntomas que lo determina el primer episodio de fiebre en el paciente. Si la toma de muestra es dentro de los primeros 3 días de inicio de los síntomas se deben realizar métodos directos para detectar la viremia en fase aguda: detección de antígeno de la proteína no estructural 1 (NS1), detección del genoma viral mediante la técnica de transcriptasa reversa en reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) o aislamiento celular; siendo este período el de mayor eficiencia de diagnóstico. Si la muestra es tomada entre los días 4-6 de evolución nos encontramos que la viremia está disminuyendo y están aumentando los anticuerpos, así que, se recomienda combinar metodología directa con metodología indirecta. Si la toma de muestra es a los 7 días o posterior se deben implementar métodos indirectos y de seroconversión, es decir, búsqueda de IgM y/o IgG en suero (ver gráfico 1). 

Métodos directos 

Detección de genoma viral por qRT-PCR: si por medio de la técnica de qRT-PCR se detecta el genoma viral de DENV es suficiente para la confirmación del diagnóstico. Por otro lado, si el resultado es no detectable se debe solicitar una nueva muestra del paciente con más días de evolución. Otro motivo por el cual puede dar falsos negativos es por la posible contaminación en el procedimiento, ya que es un virus de ARN y lo puede afectar cualquier ARNasa que esté presente. Por esta razón es muy importante la utilización de los controles interno, positivo y negativo para corroborar que no existan inhibidores o que la muestra esté contaminada. Si bien el pico máximo de viremia ocurre al tercer día y luego desciende, con esta metodología es posible detectar el genoma hasta el quinto día con una sensibilidad adecuada. También es posible detectar DENV en orinas en pacientes con más de 7 días de evolución de la infección. Hay disponibles varios formatos de multiplex que detectan diferentes targets, como, por ejemplo, detección de DENV, identificación de los distintos serotipos o detección de DENV más CHIKV y ZIKV, entre otros. Para la elección de un reactivo adecuado es importante evaluar la sensibilidad y especificidad de detección para los 4 serotipos, aun así, no los diferencie. Se pueden procesar muestras de LCR con esta metodología en casos de compromiso neurológico. 

Detección de antígeno NS1 por ELISA: el resultado positivo de la detección del antígeno viral NS1 por metodología de ELISA es confirmatorio para el diagnóstico de la infección por DENV. Es muy importante verificar la sensibilidad a los distintos serotipos, ya que, por lo general algunos kits comerciales pueden presentar menor sensibilidad para los serotipos DEN-2 y DENV-4 por el diseño de los anticuerpos monoclonales que utilizan, los cuales tienen menor afinidad por estos serotipos. No es posible distinguir serotipos con este tipo de determinación. La detección de NS1 por metodología inmunocromatográfica o test rápido (TR) no es suficiente para confirmar diagnóstico. En pacientes recientemente vacunados no se detecta antígeno NS1, manteniendo su utilidad diagnóstica para aquellos vacunados y con síntomas de infección por DENV. 

Genoma viral vs. NS1: si bien ambos métodos son directos y se utilizan en el mismo momento de evolución del paciente hay algunos puntos a diferenciar entre ellos. Si la qRT-PCR no está disponible por su complejidad, se puede considerar la detección del antígeno NS1 por ELISA teniendo en cuenta que su sensibilidad es menor que qRT-PCR. En el estudio publicado por Nishat Hussain Ahmed, donde compara ambos métodos vs. los días de evolución de la patología en pacientes del Hospital and Research Institute (India), se observa una mayor sensibilidad en la detección del genoma del DENV por metodología qRT-PCR que la determinación del antígeno NS1 por ELISA. Esta última presenta una sensibilidad del 50% al día 1, llegando al pico máximo de 100% al día 2 y luego disminuye gradualmente al día 5 con una sensibilidad del 50%. Por otro lado, la metodología de biología molecular comienza en el día 1 con una sensibilidad mayor, siendo del 75%, pasado al 83% en el día 2 y su máxima sensibilidad al día 3 con 93%, para luego disminuir de la misma forma que la técnica de ELISA (Tabla 1). 

Métodos indirectos 

Detección de anticuerpo IgM: a partir del día 3 de inicio de la fiebre un resultado positivo es un diagnóstico probable y si es negativo se debe solicitar otra muestra con más días de evolución. No es diagnóstico confirmatorio porque se ha demostrado que pueden permanecer en circulación hasta por un año. Por lo tanto, la IgM es un marcador de infección reciente y no de infección aguda. Esto se agrava en épocas de brote, limitando su utilidad por la persistencia de su detección en suero. Además, puede presentar reacción cruzada con otros flavovirus, como por ejemplo un paciente vacunado por fiebre amarilla. Por lo tanto, se debe confirmar el resultado positivo con una prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT, por su sigla en inglés) y es considerada el ensayo de referencia para la detección serológica de infecciones arbovirales. La prueba se basa en la capacidad de los anticuerpos séricos de las personas infectadas de neutralizar la infección viral en cultivos celulares, realizándose en centros de referencia. 

Un resultado negativo en una muestra de 5 días de evolución o posterior descarta el diagnóstico de dengue. 

Cuando se presentan complicaciones neurológicas, la detección de IgM se realiza en suero y en LCR simultá- neamente. El LCR puede analizarse tanto en su forma pura como diluida (dilución máxima de 1:5). La presencia de IgM en el LCR confirma una infección reciente del sistema nervioso central, aunque se debe considerar la posible persistencia de los anticuerpos IgM y la posible reactividad cruzada entre virus del mismo género. 

La reactividad cruzada se observa con mayor frecuencia en las reinfecciones que en las primoinfecciones. Por ende, en regiones donde diversos flavovirus circulan simultáneamente o han circulado anteriormente, tal como ocurre en gran parte de las Américas, la probabilidad de reactividad cruzada es elevada. 

Detección de anticuerpo IgG: es un marcador de menor utilidad. Presenta una persistencia de años en sangre. Por otro lado, la seroconversión si es funcional al diagnóstico, procesando 2 muestras con una semana de diferencia entre ellas. En casos de reinfección también se puede evidenciar con el aumento de títulos 4 veces de su valor, para lo cual es necesario utilizar una metodología cuantitativa. En esta determinación también se presenta la limitación de la reactividad cruzada con otro virus. 

En paciente recientemente vacunados se puede detectar anticuerpos IgM e IgG durante el plazo de 30 días por lo menos, disminuyendo su utilidad diagnóstica en este tipo de población. 

A pesar presentar limitaciones, la detección de anticuerpos por serología forman parte de los métodos de diagnóstico de las infecciones por arbovirus, ya que, el uso de los métodos directos depende de la buena calidad de las muestras y la obtención de la misma debe ser dentro de los días donde la viremia sea detectable. También aumentan su utilidad en laboratorios donde no se dispongan de tecnología de cultivo celular ni de biología molecular y su costo es notablemente menor. 

Tener en cuenta que la combinación de métodos directos e indirectos puede mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico por laboratorio de esta patología. 

Metodología por inmunocromatografía o TR 

No se recomienda el uso de TR en áreas sin circulación autóctona del virus, como tampoco en períodos interepidémicos. Los TR que detecten antígeno NS1 y/o anti-cuerpos IgM e IgG se recomiendan utilizar en épocas de epidemia como refuerzo de respuesta laboratorial con circulación comprobada, siendo una prueba confirmatoria de diagnóstico. Si el resultado es negativo para los 3 parámetros con una muestra de menos de 5 días de evolución se debe pedir nueva muestra, pero si es con más de 5 días de evolución se puede descartar el diagnóstico. Si solo es positivo la detección de anticuerpos tipo IgG puede tratarse de un caso de infección pasada o si solamente se detecta el antígeno NS1 es un caso pro-bable de dengue. También este tipo de pruebas son de utilidad como vigilancia epidemiológica en los laboratorios públicos. 

Conclusión 

Se sabe que el tratamiento del dengue tiende a ser con-servador y se inicia en el momento de la sospecha clínica. No obstante, es fundamental realizar un seguimiento riguroso del estado clínico y de los parámetros hematoló- gicos para evitar complicaciones, lo que hace relevante la importancia del diagnóstico temprano. Este diagnóstico precoz también es crucial para diferenciar los síntomas del dengue con otras enfermedades febriles que pueden presentarse durante los brotes de dengue. 

Referencias Bibliográficas

 • Vigilancia epidemiológica y laboratorial – Ministerio de salud de la nación (Argentina), 2024. 

• Dengue en niños y en adultos: Diagnóstico, manejo clínico y vacunas- SAV, 2023. 

• Nota técnica: Algoritmo para la confirmación por laboratorio de casos de dengue. OPS, 2023. 

• Comparison of NS1 antigen detection ELISA, real time RT-PCR and virus isolation for rapid diagnosis of dengue infection in acute phase. Nishat Hussain Ahmed & Sho-bha Broor – Hospital and Research Institute, Gurgaon, India, 2014. 

Recomendaciones para la detección y el diagnóstico por laboratorio de infecciones por arbovirus en la Región de las Américas – OPS, 2022. 

Informe de situación No 28. Situación epidemiológica del dengue en las Américas – OPS, semana epidemiológica 28, 2024.