Revista Bioreview Edición 42 - Febrero 2015

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Virus Chikungunya: Parte I

Preparación y respuesta ante la eventual intoducción del virus chikungunya en la Américas

Organización Panamericana de la Salud

Preparación y respuesta ante la eventual intoducción del virus chikungunya en la Américas

Washington, DC.:OPS, © 2011

Presentación clínica de la enfermedad

Después de la picadura de un mosquito infectado con CHIKV, la mayoría de los individuos presentaran síntomas tras un periodo de incubación de tres a siete días (rango: 1-12 días). Sin embargo, no todos los individuos infectados desarrollarán síntomas. Estudios serológicos indican que entre el 3% y el 28% de las personas con anticuerpos para el CHIKV tienen infecciones asintomáticas.6-7

Los individuos con infección aguda por CHIKV con manifestaciones clínicas o asintomáticas, pueden contribuir a la diseminación de la enfermedad si los vectores que transmiten el virus están presentes y activos en la misma zona.

El CHIKV puede causar enfermedad aguda, subaguda y crónica. La enfermedad aguda generalmente se caracteriza por inicio súbito de fiebre alta (típicamente superior a 39°C [102°F]) y dolor articular severo.8-10 Otros signos y síntomas pueden incluir cefalea, dolor de espalda difuso, mialgias, nauseas, vómitos, poliartritis, rash y conjuntivitis (Tabla 1).11 La fase aguda dura entre 3 y 10 días.

• La fiebre generalmente dura entre unos días y una semana. Puede ser continua o intermitente, pero una disminución de la temperatura no se asocia a empeoramiento de los síntomas. Ocasionalmente, la fiebre puede acompañarse de bradicardia relativa.

• Los síntomas articulares generalmente son simétricos y ocurren con más frecuencia en manos y pies, pero también pueden afectar articulaciones más proximales.

También se puede observar tumefacción, asociada con frecuencia a tenosinovitis. A menudo los pacientes están gravemente incapacitados por el dolor, la sensibilidad, la inflamación y la rigidez. Muchos pacientes no pueden realizar sus actividades habituales ni ir a trabajar, y con frecuencia están confinados al lecho debido a estos síntomas.

• El rash aparece generalmente entre dos a cinco días después del inicio de la fiebre en aproximadamente la mitad de los pacientes. Es típicamente maculopapular e incluye tronco y extremidades, aunque también puede afectar palmas, plantas y rostro. El rash también puede presentarse como un eritema difuso que palidece con la presión. En los niños pequeños, las lesiones vesiculobulosas son las manifestaciones cutáneas más comunes.

No se observan hallazgos hematológicos patognomónicos significativos en las infecciones por CHIKV. Los hallazgos de laboratorio anormales pueden incluir ligera trombocitopenia (>100.000/mm3), leucopenia y pruebas de función hepática elevadas. La velocidad de sedimentación globular y la proteína C reactiva están generalmente elevadas.

En raras ocasiones, pueden ocurrir formas graves de la enfermedad con manifestaciones atípicas. Se considera que las muertes relacionadas con infección por CHIKV son raras. Sin embargo, se reportó un aumento en las tasas brutas de mortalidad durante las epidemias de 2004/2008 en la India y Mauricio.18, 19

Clínica

Ver imágenes a la derecha.

Créditos de las fotografías:

(A), (N) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia. Publicado previamente en: Simon F, Javelle E, Oliver M, Leparc-Goffart I, Marimoutou C. Chikungunya virus infection. Curr Infect Dis Rep. 2011 Jun;13 (3):218-28.

(B) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia. Publicado previamente en: Simon F. et al. Chikungunya infection: an emerging rheumatism among travelers returned from Indian Ocean islands. Report of 47 cases. Medicine (Baltimore). 2007 May ;86(3):123-37.

(C), (D), (I), (K), (L), (M) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia.

(E), (G), (J) Dr. Bernard Lamey y Dr. Sophie Fite. Dermatólogos. Société Réunionnaise de Dermatologie – Groupe Nord. France. Publicado previamente en: Lamey B, Fite S. Fièvre de Chikungunya : formes cliniques et manifestations dermatologiques. Nouv. Dermatol. 2007;26 :66-74.

(F) Dr. Bernard Lamey y Dr. Sophie Fite. Dermatólogos. Société Réunionnaise de Dermatologie. Groupe Nord. Francia.

(H) Dr. Stéphanie Robin y Dr. Duksha Ramful, Servicio de Pediatría, CHR Félix Guyon, Saint-Denis de La Réunion.

Aunque la mayoría de las infecciones por CHIKV se manifiestan con fiebre y artralgias, también pueden ocurrir manifestaciones atípicas (Tabla 2). Estas manifestaciones pueden deberse a efectos directos del virus, la respuesta inmunológica frente al virus, o la toxicidad de los medicamentos.

Determinadas manifestaciones atípicas son más comunes en ciertos grupos. Por ejemplo, la meningoencefalitis y la dermatosis vesículobulosa se observan con más frecuencia en niños y lactantes, respectivamente.21, 22

Grupos de alto riesgo

El CHIKV puede afectar a mujeres y hombres de todas las edades. Sin embargo, se considera que la presentación clínica varía con la edad, siendo los individuos muy jóvenes (neonatos) y los ancianos, más propensos a desarrollar formas más graves.23-26 Además de la edad, se han identificado las comorbilidades (enfermedades subyacentes) como factores de riesgo para una evolución desfavorable.8, 23, 24, 27

En la mayoría de las infecciones por CHIKV que ocurren durante el embarazo el virus no se transmite al feto. 25, 28 Sin embargo, existen reportes puntuales de abortos espontáneos después de una infección por CHIKV en la madre.26 El riesgo más alto de transmisión parece producirse cuando la mujer está infectada en el periodo intraparto,29 momento en el que la tasa de transmisión vertical puede alcanzar un 49%. Los niños generalmente nacen asintomáticos y luego desarrollan fiebre, dolor, rash y edema periférico. Aquellos que se infectan en el periodo intraparto también pueden desarrollar enfermedad neurológica (por ej., meningoencefalitis, lesiones de la sustancia blanca, edema cerebral y hemorragia intracraneana), síntomas hemorrágicos y enfermedad del miocardio.30 Los hallazgos de laboratorio anormales incluyen pruebas de función hepática elevadas, recuentos bajos de plaquetas y linfocitos, y disminución de los niveles de protrombina. Los neonatos que sufren enfermedad neurológica generalmente desarrollan discapacidades a largo plazo.31 No hay evidencia de que el virus se transmita a través de la leche materna.25

Los adultos mayores son más propensos a experimentar enfermedad atípica grave y muerte. Los individuos >65 años presentaron una tasa de mortalidad 50 veces mayor a la de los adultos más jóvenes (<45 años).23 Aunque no está claro porque los adultos mayores tienen mas riesgo de enfermedades graves, puede deberse a que se presentan con mayor frecuencia enfermedades concomitantes subyacentes o respuestas inmunológicas disminuidas.2. 

Diagnóstico diferencial

La fiebre, con o sin artralgias, es una manifestación atribuible a muchas otras enfermedades. La CHIK puede presentarse de forma atípica o puede coexistir con otras enfermedades infecciosas como el dengue o la malaria. Las enfermedades a ser consideradas en el diagnóstico diferencial pueden variar en relación a algunas características epidemiológicas relevantes, tales como el lugar de residencia, antecedentes de viajes y exposición (Tabla 3).

Superposición y confusión con el Dengue:

Se debe distinguir la CHIK del dengue, que puede tener una evolución más tórpida, ocasionando inclusive la muerte. Ambas enfermedades pueden ocurrir al mismo tiempo en un mismo paciente. Observaciones realizadas durante brotes previos en Tailandia y la India, revelan las características principales que distinguen la CHIK del dengue. En la CHIK rara vez se observan shock o hemorragia severa; el inicio es más agudo y la duración de la fiebre es mucho menor. En la CHIK el rash maculopapular también es más frecuente que en el dengue (Tabla 4). Si bien en ambas enfermedades los pacientes pueden padecer dolor corporal difuso, el dolor es mucho más intenso y localizado en las articulaciones y tendones en la CHIK que en el dengue.

Enfermedad subaguda y crónica

Después de los primeros 10 días, la mayoría de los pacientes sentirá una mejoría en su estado general de salud y del dolor articular. Sin embargo, posteriormente puede ocurrir una reaparición de los síntomas y algunos pacientes pueden presentar síntomas reumáticos como poliartritis distal, exacerbación del dolor en articulaciones y huesos previamente lesionados, y tenosinovitis hipertrófica subaguda en muñecas y tobillos. Estos síntomas son más comunes dos o tres meses después del inicio de la enfermedad. Algunos pacientes también pueden desarrollar trastornos vasculares periféricos transitorios, tales como el síndrome de Raynaud. Además de los síntomas físicos, la mayoría de los pacientes sufrirá síntomas depresivos, fatiga general y debilidad.13

La enfermedad crónica se caracteriza por la persistencia de síntomas por más de tres meses. La frecuencia con que los pacientes reportan síntomas persistentes varía sustancialmente según el estudio y el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y el seguimiento. Estudios hechos en Sudáfrica reportan que 12%?18% de los pacientes tendrán síntomas persistentes a los 18 meses y hasta 2 a 3 años despues.35, 36 En estudios más recientes de la India, la proporción de pacientes con síntomas persistentes a los 10 meses fue de 49%.37 Datos de La Reunión encontraron que hasta 80%?93% de los pacientes experimentará síntomas persistentes 3 meses después del comienzo de la enfermedad; esta proporción disminuye a 57% a los 15 meses y a 47% a los 2 años 38, 39 (F. Simone, Dpto. de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical, Hospital Militar Laveran, Marsella, Francia, comunicación personal).

El síntoma persistente más frecuente es la artralgia inflamatoria en las mismas articulaciones que se vieron afectadas durante la etapa aguda. Generalmente no hay cambios significativos en las pruebas de laboratorio ni en las radiografías de las áreas afectadas. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan artropatía/artritis destructiva, semejante a la artritis reumatoidea o psoriásica.40 Otros síntomas o molestias durante la fase crónica pueden incluir fatiga y depresion.6 Los factores de riesgo para la persistencia de los síntomas son la edad avanzada (>65 años), los trastornos articulares preexistentes y la enfermedad aguda más severa.38, 41

Laboratorio

Tipos de pruebas de laboratorio disponibles y muestras requeridas

Para el diagnóstico de CHIK se utilizan tres tipos principales de pruebas: aislamiento viral, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) y serología. Las muestras tomadas durante la primera semana del inicio de los síntomas deben analizarse por métodos serológicos (ELISA para la detección de inmunoglobulina M [IgM] y G [IgG]) y virológicos (RT-PCR y aislamiento). Las muestras generalmente son sangre o suero, pero en casos neurológicos con características meningoencefálicas también se puede obtener líquido cefalorraquídeo (LCR). Se dispone de poca información sobre la detección del virus por aislamiento o RT-PCR a partir de tejidos u órganos.

Ante la sospecha, en casos fatales, se puede intentar la detección del virus en las muestras disponibles.

La elección de la prueba de laboratorio apropiada se basa en el origen de la muestra (humano o mosquitos recogidos en campo) y en el momento de recolección de la muestra con relación al comienzo de los síntomas (en el caso de muestras de origen humano).

Aislamiento viral

El aislamiento del virus puede realizarse a partir de mosquitos recogidos en campo o muestras de suero de la fase aguda (?8 días). El suero obtenido de la sangre total extraída durante la primera semana de la enfermedad y transportada al laboratorio en frío (entre 2°?8°C o hielo seco) lo más rápidamente posible (?48 horas) se puede inocular en una línea celular susceptible o en ratón lactante. El CHIKV producirá los efectos citopáticos típicos (ECP) dentro de los tres días posteriores a su inoculación en una variedad de líneas celulares, que incluyen células Vero, BHK-21 y HeLa. El aislamiento del virus puede realizarse en frascos de cultivo T-25 o viales shell (ver Apéndice A). Datos recientes sugieren que el aislamiento en viales shell es más sensible y produce ECP antes que el aislamiento convencional en frascos de cultivo.42 El aislamiento del CHIKV debe confirmarse ya sea por inmunofluorescencia (IF) usando antisuero específico para CHIKV, o por RT-PCR del sobrenadante del cultivo o suspensión de cerebro de ratón. El aislamiento del virus solo debe realizarse en laboratorios con nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) para reducir el riesgo de transmisión viral.

RT-PCR

Se han publicado diversas pruebas diagnósticas de RT-PCR para la detección del ARN del CHIKV. Se deben utilizar pruebas en tiempo real con sistema cerrado debido a que presentan mayor sensibilidad y menor riesgo de contaminación.

El laboratorio de diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC, utiliza de rutina la prueba publicada en el Apéndice B,43 que ha demostrado una sensibilidad de menos de 1 unidad formadora de placa (ufp) o 50 copias genómicas. Se utiliza suero obtenido de sangre total, tanto para la PCR como para el aislamiento viral.

Pruebas serológicas

Para el diagnóstico serológico se utiliza el suero obtenido de sangre total en la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y en la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT). La muestra de suero (o sangre) debe ser transportada a 2°?8°C, sin congelar. El diagnóstico serológico puede hacerse por demostración de anticuerpos IgM específicos para CHIKV o por un aumento de cuatro veces en el título de PRNT entre muestras de fase aguda y fase convaleciente. La determinación de anticuerpos IgM específicos para CHIKV se realiza mediante ELISA de captura del anticuerpo IgM (MAC-ELISA),44 seguido de PRNT (el Apéndice C muestra los protocolos detallados de ELISA IgM e IgG). Hasta el año 2010, no habían ELISAs IgM validados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) comercialmente disponibles. Se requiere PRNT para confirmar los resultados de MAC-ELISA, ya que se ha observado reactividad cruzada en MAC-ELISA con algunos miembros del serogrupo del virus Semliki Forest (SFV). La prueba de PRNT, ya sea usada para confirmar el MACELISA o para demostrar un aumento de cuatro veces entre muestras agudas/convalecientes, deberá incluir siempre otros virus del serogrupo SFV (por ej., virus Mayaro) para validar la especificidad de la reactividad. En situaciones en las que no se dispone de PRNT, se pueden utilizar otras pruebas serológicas (por ej., inhibición de la hemaglutinación [HI]) para identificar una infección reciente por un alfavirus; sin embargo, se requiere PRNT para confirmar una infección reciente por CHIKV.

Se debe recolectar suero de la fase aguda inmediatamente después del inicio de la enfermedad y suero de la fase convaleciente 10?14 días después. Generalmente se desarrolla la IgM específica para CHIKV y anticuerpos neutralizantes hacia el final de la primera semana de la enfermedad. Por lo tanto, para descartar definitivamente el diagnóstico, se deben obtener muestras de la fase convaleciente en pacientes cuyas muestras de la fase aguda fueron negativas.

Recolección, almacenamiento y transporte de muestras

La recolección, el procesamiento, el almacenamiento y el transporte adecuado de las muestras son aspectos esenciales para el diagnóstico de laboratorio.

Recolección de muestras para serología, aislamiento viral y diagnóstico molecular

Muestra: Suero

Momento de recolección: Fase aguda: durante los primeros ocho días de la enfermedad; fase convaleciente: 10?14 días después de la recolección de la muestra de la fase aguda.

Para la recolección del suero:

• Recoger de forma aséptica 4-5 mL de sangre venosa en un tubo o vial.

• Permitir que la sangre se coagule a temperatura ambiente, centrifugar a 2.000 rpm para separar el suero. Recolectar el suero en un vial limpio y seco.

• Todas las muestras clínicas deben estar acompañadas de información clínica y epidemiológica.

Otros tipos de muestras para examen de laboratorio

Muestras:

• LCR en caso de meningoencefalitis.

• Líquido sinovial en caso de artritis con derrame.

• Material de autopsia – suero o tejidos disponibles.

[Nota: Los mosquitos recogidos en campo también se manipularan usando las mismas técnicas descritas en el documento: Preparación y respuesta ante la eventual introducción del virus chikungunya en las Américas].

Transporte de muestras:

• Transportar las muestras al laboratorio a 2°?8°C (refrigerador portátil) lo más rápidamente posible.

• No congelar la sangre total, ya que la hemólisis puede interferir con los resultados de las pruebas serológicas.

• Si se prevé una demora mayor a 24 horas para el envío de las muestras al laboratorio, el suero debe separarse y conservarse refrigerado.

• Las muestras de suero para aislamiento viral y diagnóstico molecular se deben conservar congeladas (a ?20°C para almacenamiento a corto plazo o a ?70°C para almacenamiento a largo plazo).

Vigilancia de laboratorio

Antes de la identificación de CHIKV en un país, se debe llevar a cabo vigilancia de laboratorio en tres grupos de muestras: 1) muestras negativas para dengue de pacientes con dolor articular grave; 2) muestras de pacientes con enfermedad clínica compatible en áreas geográficas sin circulación activa de dengue; 3) conglomerados de pacientes con enfermedad febril y dolor articular grave. La siguiente tabla (Tabla 5) describe las pruebas idóneas para diversos contextos epidemiológicos.

Durante la introducción inicial del CHIKV en una nueva región, se deben realizar pruebas exhaustivas para confirmar que el CHIKV es el agente etiológico. Una vez identificado el CHIKV se puede considerar limitar las pruebas (no analizar todas las muestras o realizar menos tipos de pruebas) dependiendo de la capacidad del laboratorio y de la situación epidemiológica.

Interpretación y notificación de los resultados

La Figura 2 muestra la típica viremia y respuesta inmune en humanos, y la Tabla 6 describe los resultados característicos de las muestras analizadas en diferentes momentos.

Los siguientes resultados confirmarían una infección reciente por CHIKV:

• Aislamiento de CHIKV, incluyendo identificación confirmatoria (ya sea por inmunofluorescencia, RT-PCR, o secuenciación).

• Detección de ARN del CHIKV mediante RT-PCR en tiempo real.

• Identificación de un resultado positivo de IgM en un paciente con síntomas agudos de CHIK, seguido por la demostración del anticuerpo específico para CHIKV por PRNT con virus del serogrupo SFV.

• Demostración de seroconversión o incremento de cuatro veces en los títulos de PRNT, HI o ELISA (nuevamente usando otros virus del serogrupo SFV) entre las muestras obtenidas en fase aguda y convaleciente.

Los casos autóctonos deben ser reportados a la OMS, con la colaboración de un epidemiólogo, de acuerdo con el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).

Red de laboratorios para el diagnóstico de CHIKV

Actualmente la DVBD, CDC, puede proveer de pruebas diagnósticas para la detección de infección por CHIKV. Los CDC y la Agencia de Salud Publica de Canadá pueden ofrecer reactivos y asesoramiento. Dependiendo de la disponibilidad de recursos y de la situación epidemiológica, la OPS y el CDC trabajaran en el futuro inmediato de manera conjunta para mejorar la detección del CHIKV en la Región, brindando capacitación y reactivos a los laboratorios de la red de dengue (RELDA) y otros arbovirus existentes en las Américas.

Asimismo, están previstas pruebas de proficiencia para garantizar la calidad de las pruebas diagnósticas en la Región. Se desarrollará un plan de contingencia para garantizar que todos los laboratorios de las Américas con capacidad para realizar las pruebas tengan el suministro de reactivos y los protocolos adecuados.

Apéndice A. Protocolo de aislamiento viral (para cultivo celular) (Cont.)

Introducción

El método óptimo para determinar la etiología específica de una infección por arbovirus requiere el aislamiento del virus a partir de una muestra obtenida del paciente durante la etapa aguda de la enfermedad y la demostración de un aumento en el título  de anticuerpos contra el virus aislado durante la convalecencia. Por varias razones, el aislamiento exitoso de la mayoría de los arbovirus a partir de muestras de pacientes es la excepción, ya sea porque la muestra a examinarse no se recoge a tiempo, no se manipula correctamente, o no se traslada de manera diligente al laboratorio para su inoculación. La viremia en humanos en muchas infecciones por arbovirus, si es detectable en algún momento, cesa en el momento o rápidamente después del inicio de los síntomas, una etapa en la que generalmente se puede demostrar la presencia de anticuerpos. Debido a que en la fase aguda algunos virus circulantes pueden ser recuperados y los anticuerpos pueden estar ausentes, o presentes en títulos bajos, se debe recoger la muestra de sangre de forma inmediata ante la sospecha de etiología viral. Una demora de más de una hora, puede comprometer la capacidad de aislar el virus; el tiempo aceptable depende del tipo de virus involucrado.

Ciertos arbovirus, como CHIKV, producen una viremia de magnitud y duración suficiente para permitir su aislamiento en sangre durante la fase aguda de la enfermedad, por ej., 0 a 5 días después del inicio de la enfermedad.

Se pueden obtener aislamientos virales de las vísceras obtenidas por biopsias o autopsia de pacientes con enfermedad aguda.

Para el aislamiento a partir del sistema nervioso central, las muestras deben tomarse de diversas áreas, incluyendo la corteza, los núcleos  cerebrales, el cerebelo y el tronco encefálico. Los arbovirus neurotrópicos pueden ser aislados en ocasiones a partir del LCR obtenido por punción lumbar durante las etapas agudas de la encefalitis o meningitis aséptica. Se han aislado alfavirus, como CHIKV, a partir del líquido sinovial de pacientes con poliartritis aguda. En algunas circunstancias se han recuperado arbovirus de orina, leche, semen y humor vítreo. 

Principio

Están disponibles sistemas de cultivo celulares susceptibles para intentar el aislamiento del presunto agente etiológico de la enfermedad. Después de un aislamiento exitoso, el virus puede identificarse positivamente y un antígeno preparado a partir de este aislamiento o el virus mismo pueden utilizarse para demostrar la presencia de anticuerpos contra el aislamiento viral. Si se detectan anticuerpos, se confirma que el virus aislado es el agente causal de la enfermedad. En algunos casos, el suero del  paciente puede no estar disponible. En estas circunstancias, se debe confiar en el reaislamiento del virus a partir de la muestra original. De cualquier manera se debe intentar el reaislamiento, esté disponible o no el suero del paciente.

Materiales y Reactivos

Cultivo en monocapa de células Vero u otros cultivos adecuados de células susceptibles. Cultivo de células C6/36 - células clonadas de Ae. albopictus.

Procedimiento

Se deben dividir los tejidos o líquidos disponibles para aislamiento viral, microscopía electrónica y examen inmunohistoquímico. Los tejidos deben recogerse de forma aséptica y transportarse rápidamente al laboratorio en transporte viral. La alícuota para aislamiento viral debe ser congelada inmediatamente a -70° C en congelador mecánico o almacenarse en hielo seco.

Las muestras para aislamiento viral se deben mantener congeladas continuamente, evitando los ciclos de congelamiento-descongelamiento que inactivan el virus. La alícuota para microscopía electrónica debe ser cortada muy fina y colocada  directamente en glutaraldehído. Los cambios autolíticos ocurren rápidamente, por lo que se deben fijar los tejidos cuanto antes. Una parte de la muestra debe ser fijada en formalina tamponada o, preferentemente, introducida en un medio de congelación y congelada para la preparación de cortes para el examen inmunohistoquímico.

Las muestras procesadas deben ser inoculadas en cultivos celulares cuanto antes. El suero de pacientes con enfermedad febril aguda puede ser usado sin diluir para el aislamiento del virus o en diluciones de 1:10 y 1:100 en un diluyente que contenga proteínas. Es importante inocular los especímenes desconocidos en dos o preferentemente más diluciones (sin diluir hasta 10-2). Se inoculan los viales Shell o los frascos de cultivo de 25cm2 de Vero, y se observa la producción de ECP durante 10-14 días. Para los viales shell se inocula un total de 400 ul y se centrifuga a 100x g por 1 hora a 37°C. Una parte del sobrenadante celular se puede recoger y examinar para detectar la presencia de virus ya sea por RT-PCR dirigida o RT-PCR consenso. Alternativamente se recolectan las células y se preparan portaobjetos para examen por inmunofluorescencia, usando anticuerpos monoclonales específicos tipo dengue.

Controles

Células Vero y C6/36 no inoculadas.

Interpretación

El aislamiento, reaislamiento e identificación definitiva del virus define al agente etiológico de la enfermedad del paciente. Si hay sueros pares o suero de la fase convaleciente del mismo paciente, el aislamiento viral identificado se analiza serológicamente con el suero del paciente para verificar la respuesta inmune a ese virus.

Apéndice B. Protocolo de la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa en tiempo real

La RT-PCR en tiempo real se puede realizar usando varios kits comercialmente disponibles. Actualmente en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC, se usan tanto el kit BioRad iScript 1 Step RT-qPCR (#170-8895) como el kit  QIAGEN QuantiTect Probe RT-PCR (#204443). Los dos kits son casi idénticos en la preparación de la prueba con una excepción: el volumen de enzima usado por reacción en el kit QIAGEN es 0,5 ul, en lugar de 1,0 ul; el volumen de agua de la mezcla maestra se modifica a 0,5 ul para ajustar esta diferencia. La preparación que se muestra a continuación es para el kit QIAGEN. Obsérvese también que el volumen de ARN agregado por reacción es 10 ul, pero puede incrementarse o reducirse ajustando  adecuadamente el volumen total con agua.

 

Preparar la mezcla maestra reactiva de acuerdo con el número de reacciones deseadas. La mezcla maestra se debe preparar en  n “cuarto limpio” que esté físicamente separado de todas las otras actividades del laboratorio y que tenga reactivos y  equipos exclusivos (por ej., pipetas). Para 10 muestras se debe preparar una mezcla maestra 10X (ver arriba) multiplicando los volúmenes de todos los reactivos individuales por 10. Combinar los reactivos en el orden mencionado anteriormente en un  tubo para centrífuga libre de RNasa sobre hielo. Dividir la mezcla maestra en 10 porciones de 40 ul cada una, ya sea en tubos ópticos de 0,2 ml para PCR (específicos para pruebas TaqMan; la emisión de la fluorescencia se lee a través de la tapa), o en una placa óptica de 96 pocillos para PCR. Finalmente se debe agregar 10 ul de la muestra de ARN solo a cada tubo o pocillo. Todas las pruebas se examinaran en pocillos duplicados. Incluir varios controles negativos “NO ARN” (NTC) agregando agua en  lugar de ARN. Incluir un control positivo o una serie de diluciones de cantidades conocidas de ARN con control positivo si se prepara una prueba cuantitativa.

Interpretación

El siguiente algoritmo es usado por el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC para evaluar los resultados de TaqMan. 
Positivo: • Valor de corte (Ct) menor o igual a 38 en pocillos duplicados.
Equívoco: • Ct menor o igual 38 en uno de los dos pocillos.
Negativo: • Ct mayor a 38 en pocillos duplicados.

Todas las muestras positivas y equívocas se repiten con un segundo juego de cebadores/sondas para confirmación. Un resultado positivo en cualquiera de los controles negativos invalida la corrida completa. Si el control positivo no genera un resultado  positivo también se invalida la corrida completa.

I. EXTRACCIÓN DE ARN

Evitar la contaminación al trabajar con ARN
• Mantener áreas de trabajo físicamente separadas; una debe estar dedicada al trabajo de preamplificación del ARN (extracción de ARN y agregado de ARN) y la otra a la producción de la mezcla maestra. 
• Utilizar equipo exclusivo o separado dentro de las áreas de pre y postamplificación, especialmente pipetas y centrífugas.
• Usar siempre guantes, incluso cuando se manipulan tubos sin abrir.
• Cerrar y abrir los tubos rápidamente evitando tocar cualquier parte del interior.
• Utilizar tubos y puntas de pipeta de plástico descartable libres de RNasa.
• Usar puntas de pipeta con bloqueo de aerosoles.
• Usar agua libre de RNasa.
• Preparar todos los reactivos sobre hielo.

1. Las muestras de fase sólida (mosquitos o tejidos) se homogenizan primero en un tampón isotónico para producir un homogeneizado líquido. Se extrae el ARN de las muestras líquidas (LCR o suero) sin ningún pretratamiento, como se describe más  adelante. Las muestras de tejido (~10mm3) se homogenizan en 1 ml de diluyente BA-1 usando trituradores de tejido TenBroeck. Los especímenes de mosquitos se homogenizan en trituradores de tejido TenBroeck o usando la técnica de triturado con  cuentas de acero revestidas de cobre (BB). Con ambas técnicas, los homogeneizados deben ser aclarados mediante centrifugación en una microcentrifugadora (por ej., Eppendorf) a velocidad máxima durante 5 minutos para sedimentar 
cualquier partícula.

2. Extraer el ARN de 140 ul de la muestra líquida (LCR, suero u homogeneizado aclarado) usando el kit QiAmp viral ARN (QIAGEN part # 52904). Seguir con exactitud el protocolo del fabricante. NOTA: Para especímenes de mosquitos agregar un lavado  adicional con AW1. Extraer por lo menos dos controles negativos y dos positivos junto con los especímenes de prueba. Los controles positivos deben diferir en la cantidad de ARN objetivo presente (es decir, predeterminar un positivo alto y un positivo  bajo). El volumen de la muestra extraída puede ser mayor o menor al volumen estándar especificado en el protocolo de QIAGEN (140 ?l) si se ajustan apropiadamente todos los otros volúmenes del protocolo.

Apéndice C. Protocolos de las pruebas serológicas (IgM e IgG)

PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCIÓN ENZIMÁTICA DE CAPTURA DE IgM

Introducción

Las pruebas que detectan inmunoglobulina M (IgM) viral específica son ventajosas porque ponen en evidencia anticuerpos producidos durante los primeros días del inicio de los síntomas clínicos en una infección primaria. Esto evita la necesidad de  muestras de fase convaleciente en muchos casos. La captura de IgM es el enfoque óptimo para la detección de IgM: es simple, sensible y es aplicable a muestras de suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) de una variedad de especies animales (por ej.,  humanas, equinas, aviares). Además, se minimizan las reacciones falso-positivas debido al factor reumatoide.

Principio

La prueba de inmunoabsorción enzimática de captura de anticuerpos IgM (MAC-ELISA) brinda una alternativa útil a la inmunofluorescencia para documentar la respuesta serológica. La prueba ELISA es menos subjetiva que la inmunofluorescencia y se  pueden procesar una gran cantidad de muestras. El principio es similar al de la inmunofluorescencia. El anti-IgM (el anticuerpo de captura) es revestido en placas de 96 pocillos en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC. Luego se adiciona secuencialmente el suero del paciente, y el antígeno viral conocido no infeccioso. La presencia del antígeno se detecta usando un anticuerpo antiviral acoplado a enzimas, y se genera un resultado colorimétrico a partir de la interacción entre la  enzima y un sustrato cromogénico. En esto consiste el MAC-ELISA.

Seguridad

El procedimiento debe realizarse en condiciones de laboratorio seguras, teniendo en cuenta la naturaleza potencialmente infecciosa de las muestras de suero involucradas. Se recomienda usar bata de laboratorio, guantes y campana de flujo laminar.

Materiales y Reactivos

Tampón de revestimiento: tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6. 1,59g Na2CO3 + 2,93g NaHCO3 diluido en 1L de agua.
Tampón de lavado: Tampón fosfato salino (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,2. PBS está disponible en polvo a partir de múltiples fuentes comerciales.
Tampón Bloqueante: PBS/ 5% leche/ 0,5% Tween 20.
Solución quelante: 1 N H2SO4.
Anticuerpo de revestimiento: Anti IgM humana de cabra. Laboratorios Kirkegaard y Perry cat# 01-10-03.
Antígeno viral: Antígenos virales inactivados, previamente titulados, preparados en cerebro de ratón lactante y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.
Antígeno normal: Antígenos preparados en cerebro de ratón lactante no infectado y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.
Conjugado para detección de anticuerpos: anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano, previamente titulado.

Sustrato: 3,3’,5,5’ tetrametilbencidina Base (TMB-ELISA), Gibco cat# 15980-0414.
Placas: Placas de 96 pocillos de fondo plano Immulon II HB. Dynatech Technologies cat# 3455.

Lavadora de microplacas
Lector de microplacas
Incubadora
Pipetas sencillas y multicanal
Reservorios para reactivos
Bolsas Ziploc, toallas de papel

Muestras clínicas

Especímenes de suero humano de la fase convaleciente y aguda y/o muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). Sueros humanos con anticuerpos positivos y negativos previamente testados para controles.

Nota: Almacenar todas las muestras para diagnóstico a 4°C antes de someterlas a análisis, y a -20°C luego de que se hayan completado todos los análisis previstos. Evitar ciclos repetidos de congelamientodescongelamiento.

Procedimiento

Nota: El siguiente procedimiento incluye información sobre control de calidad e interpretación de resultados. Cada muestra de suero se analiza por triplicado tanto para antígenos virales como normales. Se pueden analizar ocho muestras para estudio por placa. Las muestras de LCR generalmente se analizan individualmente.

1. Usando un marcador indeleble de punta fina, numerar y rotular las placas. Identificar la ubicación de cada muestra clínica (S1?S8) utilizando el código de laboratorio correspondiente. Para mantener los tiempos para el agregado de reactivos de manera  consistente, procesar las placas en el orden en que están numeradas durante todos los pasos del procedimiento. Las placas deben mantenerse en un ambiente cerrado y humidificado durante todo el tiempo de incubación, excepto en el paso de  revestimiento. Para ello es útil una bolsa Ziploc grande que contenga una toalla de papel húmeda.

2. Revestir los 60 pocillos internos de las placas de 96 pocillos con 75 ul por pocillo de anti IgM humana de cabra 1:2000 diluido en tampón de revestimiento pH 9,6. Incubar a 4°C durante la noche.

3. Vaciar el anticuerpo de revestimiento y secar las placas sobre toallas de papel. Bloquear las placas con 200 ul de tampón bloqueante por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

4. Lavar los pocillos 5X con tampón de lavado usando una lavadora de placas automática. Los pocillos se deben llenar completamente para cada ciclo.

5. Agregar a un bloque de seis pocillos 50 ul por pocillo del suero del paciente (S) diluido al 1:400 en tampón de lavado, o agregar el LCR del paciente sin diluir a dos pocillos solamente, para que el LCR sea examinado individualmente con los antígenos virales y normales Nota: El LCR puede ser diluido hasta un máximo de 1:5 en tampón de lavado si es necesario. Agregar suero humano de control positivo (Ref) diluido en tampón de lavado de acuerdo a la titulación previa y suero humano de control  negativo (N) diluido 1:400 en tampón de lavado a un bloque de seis pocillos cada uno. Incubar las placas por 1 hora a 37°C en cámara humidificada.

6. Lavar 5X.

7. Diluir el antígeno viral en tampón de lavado de acuerdo con la titulación previa. Agregar 50 ul por pocillo en los tres pocillos izquierdos de cada bloque de suero. A los tres pocillos derechos de cada bloque agregar 50 ul por pocillo de antígeno normal diluido en tampón de lavado en la misma concentración que el antígeno viral. Incubar durante la noche a 4°C en cámara humidificada.

8. Lavar 5X.

9. Agregar 50 ul por pocillo de anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano, con amplia reactividad cruzada para el grupo antigénico viral apropiado, diluido en tampón bloqueador, de acuerdo a la titulación previa. Incubar durante una  hora a 37°C en cámara humidificada.

10. Encender el lector de placas para que se caliente y retirar el TMB-ELISA del refrigerador

11. Lavar las placas 5X dos veces. Girar las placas 180o en la lavadora después de la primera serie de cinco ciclos. Esto promueve resultados consistentes.

12. Mientras la placa está a temperatura ambiente agregar 75ul por pocillo de sustrato TMB a todos los pocillos. Cubrir inmediatamente las placas para evitar la luz. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se desarrollará un color azul en los pocillos con anticuerpos positivos.

13. Agregar 50 ul por pocillo de solución quelante a todos los pocillos de la placa, incluyendo las hileras de pocillos exteriores (el lector de placa debe colocarse en cero en algunos de estos pocillos). Los pocillos azules se tornarán de color amarillo. Dejar reposar las placas a temperatura ambiente durante un minuto. Leer las placas en lector de placas de microtitulación usando un filtro de 450 nm.

Consideraciones prácticas

1. Las placas se pueden cubrir y conservar a 4°C hasta una semana.

2. Los sueros de control sin diluir se pueden conservar a 4°C hasta dos semanas

3. Los antígenos virales y normales reconstituidos, sin diluir pueden almacenarse a -20°C por un período de tiempo indefinido.

4. Los sueros para estudio y los de control se pueden diluir a las diluciones de trabajo y refrigerarse un día antes de usar. Los antígenos y el conjugado deben diluirse a las diluciones de trabajo inmediatamente antes de usar. La prueba MAC-ELISA se  debe reestandarizar periódicamente. Esto debería hacerse cuando se introducen nuevos números de lote de reactivos, y como mínimo, una vez al año. Se recomienda que la densidad óptica (DO) media de la reacción del suero de control positivo con el  antígeno viral se establezca en aproximadamente 1,0. La reacción del suero de control normal con el antígeno viral debe estar en alrededor de 0,2 (esto varía). Generalmente se logra la estandarización de los reactivos mediante titulación, comparando  siempre las densidades ópticas de los reactivos cuando reaccionan con el antígeno viral y normal.

Resultados

Antes de calcular los resultados de cada muestra clínica, se debe determinar que la prueba es válida. Para que una prueba se considere válida, debe cumplir lo siguiente: 


El cociente debe ser mayor o igual a 2,0. Esto es el P/N del control positivo.
Se debe determinar la validez de la prueba para cada placa. Los resultados para las muestras clínicas sólo se pueden determinar si la prueba es válida. Si la prueba no es válida, se debe repetir la placa. Si la prueba falla incluso después de una  repetición, entonces uno o más reactivos o parámetros de la prueba pueden estar equivocados y se debe buscar la solución del problema.

Para determinar si las muestras clínicas (S1-S8) contienen IgM contra el antígeno viral (lo que indicaría infección reciente por ese virus) se debe calcular lo siguiente:

Esto es el P/N de la muestra examinada. Para que una muestra se considere IgM-positiva para el virus, P/N debe ser mayor o igual a 2,0.

Además, el valor de P para la muestra examinada debe ser mayor o igual al doble de la DO media de la muestra examinada reactivada en antígeno normal. Si no se cumple con este requisito, se ha generado un entorno no específico y el resultado debe ser reportado como no interpretable.

Interpretación

Todos los valores P/N mayores o iguales a 2,0 deben reportarse como presuntos IgM-positivos (ver el párrafo siguiente), siempre que cumplan con los requisitos enumerados anteriormente. En caso de que el LCR o suero de la fase aguda temprana sean  negativos según esta prueba, se debe pedir y examinar el suero de la fase convaleciente antes de reportar a este paciente como negativo, sin evidencia serológica de infección viral reciente. Sin el examen de una muestra de la fase convaleciente, un  resultado negativo puede reflejar que la muestra de la fase aguda se obtuvo antes de que el anticuerpo haya llegado a niveles detectables. En la mayoría de los pacientes, la IgM sepuede detectar ocho días después del inicio de los síntomas de una  infección por virus del grupo alfa-, flavi-, o California. La IgM persiste por lo menos por 45 días, y generalmente hasta 90 días.

El punto de corte para el valor P/N positivo de 2,0 es empírico, en base a la experiencia y el consenso. Los valores P/N entre 2,0 y 3,0 deben considerarse como probables falso-positivos. Se deben realizar otras pruebas adicionales para confirmar el  resultado de estas muestras.

Se debe destacar que el valor P/N de una prueba a la dilución de 1:400 no es indicativa de su concentración absoluta de anticuerpos, es decir el valor P/N no es cuantitativo.

Se recomienda además que para las muestras de suero, todos los resultados positivos se confirmen mediante titulación usando 6 diluciones dobles de las muestras de suero comparándolas con una titulación similar del suero de control negativo. Las curvas de titulación lineales indican seropositividad verdadera. Las  curvas de titulación planas u ondulantes indican resultados falso-positivos.

PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCIÓN ENZIMÁTICA DE IgG

Introducción

La inmunoglobulina G (IgG) es menos específica para el virus que la IgM, aparece en suero un poco después que ésta en el curso de la infección, y permanece detectable hasta mucho después que la IgM deja de estar presente. Usando IgG-ELISA en paralelo con la prueba de Inmunoabsorción Enzimática de Captura de Anticuerpos IgM (MAC-ELISA), se pueden observar el aumento y disminución relativos de los niveles de anticuerpos en las muestras de suero pareadas. La prueba es simple y  sensible. Es aplicable a muestras de suero pero generalmente no a muestras de LCR. Las reacciones falso-positivas debido al factor reumatoide están minimizadas.

Principio

La prueba IgG-ELISA ofrece una alternativa útil frente a la inmunofluorescencia para la identificación de un aislamiento viral o para documentar la respuesta serológica. La prueba IgG-ELISA es menos subjetiva que la inmunofluorescencia y se pueden  procesar una gran cantidad de muestras. El anticuerpo monoclonal reactivo al grupo viral es recubierto en placas de 96 pocillos, seguido secuencialmente por el antígeno viral conocido, el suero del paciente, IgG humana conjugada con una enzima y  finalmente sustrato para el conjugado utilizado. En esto consiste la prueba IgG-ELISA usada en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC.

Seguridad

El procedimiento se debe realizar en condiciones de laboratorio seguras que tengan en cuenta la naturaleza potencialmente infecciosa de las muestras de suero involucradas. Se recomienda el uso de bata de laboratorio, guantes y campana de flujo  laminar.

Materiales y Reactivos

Tampón de revestimiento: Tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6, 1,59g Na2CO3 + 2,93g NaHCO3 diluido en 1L agua.

Tampón de lavado: Tampón fosfato salino (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,2. PBS disponible en polvo a partir de múltiples fuentes comerciales.

Tampón bloqueante: 3% suero de cabra, 1% Tween 20, en PBS.

Anticuerpo de revestimiento: Anticuerpo monoclonal específico de grupo, previamente titulado.

Antígeno viral: Antígenos virales inactivados, previamente titulados, preparados en cerebro de ratón lactante y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.

Antígeno normal: Antígenos preparados en cerebro de ratón lactante no infectado y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.

Conjugado para detección de anticuerpos: anti IgG humana de cabra porción Fc Gamma conjugada con fosfatasa alcalina, previamente titulada (Jackson Immunoresearch cat# 109-055-098).

Sustrato: 3 mg/ml p-nitrofenil fosfato, disodio (Sigma 104, Sigma diagnostics cat# 104-105) en 1M Tris (base) pH 8,0 (nota: El Tris requiere considerable conc. de HCl para el ajuste del pH).

Solución quelante: 3M NaOH.

Placas: Placas de 96 pocillos de fondo plano Immulon II HB. Dynatech Technologies cat# 3455.
Lavadora de microplacas
Lector de microplacas
Incubadora
Pipetas sencillas y multicanal
Reservorios para reactivos
Bolsas Ziploc, toallas de papel

Muestras clínicas

Sueros humanos de la fase aguda y convaleciente

Nota: Conservar todas las muestras para diagnóstico a 4°C antes de someterlas a análisis, y a -20°C después de haber completado todas las pruebas previstas. Evitar ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento.

Procedimiento

Nota: El siguiente procedimiento incluye información sobre control de calidad e interpretación de los resultados. Cada muestra de suero se examina por triplicado tanto para antígenos virales como normales. Se pueden analizar ocho muestras para estudio por placa.

1. Con un marcador indeleble de punta fina, numerar y rotular las placas. Identificar la ubicación de cada muestra clínica (S1-S8) utilizando el código de laboratorio correspondiente. Para mantener los tiempos para el agregado de reactivos de manera  consistente, procesar las placas en el orden en que están numeradas durante todos los pasos del procedimiento. Las placas deben mantenerse en un ambiente cerrado y humidificado durante todo el tiempo de incubación, excepto en el paso de  revestimiento. Para ello es útil una bolsa Ziploc grande que contenga una toalla de papel húmeda.

2. Revestir los 60 pocillos internos de las placas de 96 pocillos con 75ul por pocillo de anticuerpo monoclonal reactivo de grupo adecuado, diluido en tampón de revestimiento de acuerdo con la titulación anterior. Incubar a 4°C durante toda la noche.

3. Vaciar el anticuerpo de revestimiento y secar las placas sobre toallas de papel. Bloquear las placas con 200ul de tampón bloqueante por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

4. Lavar los pocillos 5X con tampón de lavado usando una lavadora de placas automática. Se deben llenar los pocillos completamente para cada ciclo.

5. Diluir el antígeno viral en tampón de lavado de acuerdo con la titulación previa. Agregar 50ul por pocillo en los tres pocillos izquierdos de cada bloque de sueros. A los tres pocillos de la derecha de cada bloque, agregar 50ul por pocillo de antígeno normal diluido en tampón de lavado en la misma concentración que el antígeno viral. Incubar durante la noche a 4°C en cámara humidificada.

6. Lavar 5X.

7. Agregar 50ul por pocillo del suero del paciente (S) diluido al 1:400 en tampón de lavado a un bloque de seis pocillos. Agregar suero humano de control positivo (Ref) diluido en tampón de lavado de acuerdo a la titulación previa, y un control de suero humano negativo (N) diluido 1:400 en tampón de lavado a un bloque de 6 pocillos cada uno. Incubar las placas durante una hora a 37°C en una cámara humidificada.

8. Lavar 5X.

9. Agregar 50ul por pocillo de anti IgG humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina diluida en tampón bloqueante, de acuerdo con la titulación anterior. Incubar durante una hora a 37°C en una cámara humidificada.

10. Encender el lector de placas para que se caliente y disolver las tabletas de sustrato en tampón tris aproximadamente 15 minutos antes de agregarlas a las placas.

11. Lavar las placas 5X dos veces. Gire las placas 180o en la lavadora después de la primera serie de cinco ciclos. Esto promueve resultados consistentes.

12. Mientras la placa está a temperatura ambiente, agregar 75ul por pocillo de sustrato Sigma 104 a todos los pocillos. Cubrir inmediatamente las placas para evitar la luz. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. En los pocillos con  anticuerpo positivo se desarrollará un color amarillo.

13. Agregar 35ul por pocillo de solución quelante a todos los pocillos de la placa, incluyendo las hileras externas (el lector de placa debe colocarse en cero en algunos de estos pocillos). Los pocillos reactivos continuarán de color amarillo. Dejar reposar  las placas a temperatura ambiente durante un minuto. Leer las placas en un lector de placas de microtitulacion usando un filtro de 405 nm.

Consideraciones prácticas

1. Las placas se pueden cubrir y mantener a 4°C hasta por una semana.
2. Los sueros de control sin diluir pueden conservarse a 4°C hasta por dos semanas.
3. Los antígenos virales y normales reconstituidos, sin diluir, pueden almacenarse a -20°C por un período de tiempo indefinido.
4. Los sueros para estudio y de control se pueden diluir a las diluciones de trabajo y refrigerarse un día antes de usar. Los antígenos y el conjugado deben diluirse a las diluciones de trabajo inmediatamente antes de usar.
La prueba IgG-ELISA debe reestandarizarse periódicamente. Esto debería ocurrir cuando se introducen nuevos números de lote de reactivos, y como mínimo, una vez al año. Se recomienda que la densidad óptica (DO) media de la reacción del suero de  control positivo con el antígeno viral se establezca en aproximadamente 1,0. La reacción del suero de control normal con el antígeno viral debe estar en alrededor de 0,2 (esto varía). Generalmente se logra la estandarización de los reactivos mediante  titulación, comparando siempre las densidades ópticas de los reactivos cuando reaccionan con el antígeno viral y normal.

Resultados

Antes de calcular los resultados de cada muestra clínica, se debe determinar que la prueba es válida. Para que una prueba se considere válida debe cumplir lo siguiente:

El cociente debe ser mayor o igual a 2,0. Esto es el P/N del control positivo. Se debe determinar la validez de la prueba para cada placa. Los resultados para las muestras clínicas sólo se pueden determinar si la prueba es válida. Si la prueba no es válida, se debe repetir esa placa. Si la prueba falla incluso después de una repetición, entonces uno o más reactivos o parámetros de prueba pueden estar equivocados y se debe buscar la solución del problema. Para determinar si las muestras clínicas (S1-S8) contienen IgG contra el antígeno viral (lo que indicaría infección reciente o previa con ese virus) se debe calcular lo siguiente:

Esto es el P/N de la muestra examinada. Para que una muestra sea considerada IgG-positiva para el virus, el P/N debe ser mayor o igual a 2,0.

Además, el valor de P para la muestra examinada debe ser mayor o igual al doble de la DO media de la muestra examinada reactivada en antígeno normal. Si no se cumple con este requisito, se ha generado un entorno no específico, y el resultado debe ser reportado como no interpretable.

Interpretación

Todos los valores P/N de los pacientes superiores o iguales a 2,0 deben ser reportados como presuntos IgGpositivos (ver párrafo explicativo en la siguiente página), mientras cumplan con los requisitos enumerados anteriormente. Las interpretaciones de IgG-ELISA siempre deben hacerse en el contexto del MAC-ELISA correspondiente, y la fecha de recolección de la muestra en relación con el inicio de los síntomas. Un resultado positivo de IgG-ELISA por si mismo no puede distinguir una infección reciente de una pasada, debido a la persistencia de la IgG de infecciones anteriores. La IgG también tiene una mayor reactividad cruzada que la IgM, por lo que un resultado positivo por IgG-ELISA puede en realidad indicar la presencia de anticuerpos frente a un virus relacionado. En la mayoría de los casos, la IgG se puede detectar 12 días después del inicio de los síntomas de una infección por virus del grupo alfa-, flavi-, o California y persiste por largos períodos de tiempo, posiblemente por años.

A continuación se enumeran algunos ejemplos de escenarios posibles:

1. Un resultado positivo de IgG-ELISA con un resultado positivo de MAC-ELISA indicaría la presencia de infección reciente.

2. Un resultado negativo de IgG-ELISA con un resultado positivo de MAC-ELISA en una muestra aguda indicarían una infección reciente en la cual el anticuerpo IgG todavía no ha alcanzado niveles detectables.

3. Un resultado positivo de IgG-ELISA y un resultado negativo de MAC-ELISA en una muestra tomada aproximadamente entre 8 y 45 días después del inicio de los síntomas sugeriría la ocurrencia de una infección pasada (recordar que la IgG para un  virus tiene con frecuencia reacción cruzada con otros virus del mismo género).

4. Una muestra única tardía (obtenida después de 45 días del inicio de los síntomas) que arroja un resultado positivo de IgG-ELISA y un resultado negativo de MAC-ELISA, no permite distinguir entre una infección reciente e infecciones pasadas.

5. Un resultado negativo de IgG-ELISA con un resultado negativo de MAC-ELISA indica la ausencia de infección reciente o pasada con el virus a prueba si la muestra fue tomada >7 días después del inicio de la enfermedad. En una muestra previa estos  resultados no permiten descartar la infección, dado que la respuesta inmune puede no haber tenido tiempo para desarrollarse.

El punto de corte para el valor P/N positivo de 2,0 es empírico, en base a la experiencia y el consenso. Los valores P/N entre 2,0 y 3,0 deben considerarse como probables falso-positivos. Se deben realizar otras pruebas adicionales para confirmar el  resultado de estas muestras. Se debe destacar que el valor P/N de una muestra a la dilución de examen de 1:400 no es indicativa de su concentración absoluta de anticuerpos, es decir, el valor P/N no es cuantitativo. También se recomienda que, para las  muestras de suero, todos los resultados positivos se confirmen mediante titulación usando 6 diluciones dobles de las muestras de suero, comparándolas con una titulación similar del suero de control negativo. Las curvas de titulación lineales indican seropositividad verdadera. Las curvas de titulación planas u ondulantes indican resultados falso-positivos.

Apéndice A

Referencias Bibliográficas

• Tsai, TH: Arboviruses, p.606-618. In Rose NR, de Marcario EC, Fahey JL, Friedman H, and Penn GM (eds): Manual of Clinical Laboratory Immunology, 4th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC, 1992.

• Karabatsos N: Arboviruses. Chap. 27. In Hsiung GD, Fong C, Landry M (eds): Diagnostic virology, 4th ed, Yale University Press, New Haven, CT, 1993.

• Schmidt NJ: Cell culture techniques for diagnostic virology. In Lennette EH, Schmidt NJ (eds): Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, 5th ed

• Beaty BJ, Calisher CH, and Shope RS: Arboviruses, p. 797-856. In Schmidt NJ, Emmons RW (eds): Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections, 6th ed, American Public Health Association, Washington, DC, 1989.

Apéndice C

Referencias Bibliográficas

• Tsai, TH: Arboviruses, In Rose NR, Marcario EC, Fahey JL, Friedman H, and Penn GM, (Eds): Manual of Clinical Laboratory Immunology, 4th Edition, American Society for Microbiology: 606-618, 1976.

• Diagnosis of Infections caused by Viruses, Chlamydia, Rickettsia, In Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, and Winn Jr. WC , (Eds): Diagnostic Microbiology, 4th Edition, JB Lippicott Co: 956-1074.

• Monath, TP, Nystrom, RR, Bailey, RE, Calisher, CH, and Muth, DJ:Immunoglobulin M antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of St. Louis encephalitis. J Clin Microbiol. 1984; 20:784-790.

• Martin, DA., Muth, DA., Brown, T., Karabatsos, N., and Roehrig, JT. Standardization of immunoglobulin M capture enzyme-linked immunosorbent assays (MAC-ELISA) for routine diagnosis of arboviral infections. J Clin Microbiol. 2000 May; 38(5): 1823-6.

Referencias Bibliográficas

• Tsai, TH: Arboviruses, In Rose NR, Marcario EC, Fahey JL, Friedman H, and Penn GM, (Eds): Manual of Clinical Laboratory Immunology, 4th Edition, American Society for Microbiology: 606-618, 1976.
• Diagnosis of Infections caused by Viruses, Chlamydia, Rickettsia, In Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, and Winn Jr. WC , (Eds): Diagnostic Microbiology, 4th Edition, JB Lippicott Co: 956-1074, 1992.
• Johnson, AJ., Martin, DA., Karabatsos, N., and Roehrig, JT. Detection of anti-arboviral immunoglobulin G by using a monoclonal antibody-based capture enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol. 2000 May; 38(5): 1827-31.

 

Presentación clínica de la enfermedad

Después de la picadura de un mosquito infectado con CHIKV, la mayoría de los individuos presentaran síntomas tras un periodo de incubación de tres a siete días (rango: 1-12 días). Sin embargo, no todos los individuos infectados desarrollarán síntomas. Estudios serológicos indican que entre el 3% y el 28% de las personas con anticuerpos para el CHIKV tienen infecciones asintomáticas.6-7

Los individuos con infección aguda por CHIKV con manifestaciones clínicas o asintomáticas, pueden contribuir a la diseminación de la enfermedad si los vectores que transmiten el virus están presentes y activos en la misma zona.

El CHIKV puede causar enfermedad aguda, subaguda y crónica. La enfermedad aguda generalmente se caracteriza por inicio súbito de fiebre alta (típicamente superior a 39°C [102°F]) y dolor articular severo.8-10 Otros signos y síntomas pueden incluir cefalea, dolor de espalda difuso, mialgias, nauseas, vómitos, poliartritis, rash y conjuntivitis (Tabla 1).11 La fase aguda dura entre 3 y 10 días.

• La fiebre generalmente dura entre unos días y una semana. Puede ser continua o intermitente, pero una disminución de la temperatura no se asocia a empeoramiento de los síntomas. Ocasionalmente, la fiebre puede acompañarse de bradicardia relativa.

• Los síntomas articulares generalmente son simétricos y ocurren con más frecuencia en manos y pies, pero también pueden afectar articulaciones más proximales.

También se puede observar tumefacción, asociada con frecuencia a tenosinovitis. A menudo los pacientes están gravemente incapacitados por el dolor, la sensibilidad, la inflamación y la rigidez. Muchos pacientes no pueden realizar sus actividades habituales ni ir a trabajar, y con frecuencia están confinados al lecho debido a estos síntomas.

• El rash aparece generalmente entre dos a cinco días después del inicio de la fiebre en aproximadamente la mitad de los pacientes. Es típicamente maculopapular e incluye tronco y extremidades, aunque también puede afectar palmas, plantas y rostro. El rash también puede presentarse como un eritema difuso que palidece con la presión. En los niños pequeños, las lesiones vesiculobulosas son las manifestaciones cutáneas más comunes.

No se observan hallazgos hematológicos patognomónicos significativos en las infecciones por CHIKV. Los hallazgos de laboratorio anormales pueden incluir ligera trombocitopenia (>100.000/mm3), leucopenia y pruebas de función hepática elevadas. La velocidad de sedimentación globular y la proteína C reactiva están generalmente elevadas.

En raras ocasiones, pueden ocurrir formas graves de la enfermedad con manifestaciones atípicas. Se considera que las muertes relacionadas con infección por CHIKV son raras. Sin embargo, se reportó un aumento en las tasas brutas de mortalidad durante las epidemias de 2004/2008 en la India y Mauricio.18, 19

Clínica

Ver imágenes a la derecha.

Créditos de las fotografías:

(A), (N) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia. Publicado previamente en: Simon F, Javelle E, Oliver M, Leparc-Goffart I, Marimoutou C. Chikungunya virus infection. Curr Infect Dis Rep. 2011 Jun;13 (3):218-28.

(B) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia. Publicado previamente en: Simon F. et al. Chikungunya infection: an emerging rheumatism among travelers returned from Indian Ocean islands. Report of 47 cases. Medicine (Baltimore). 2007 May ;86(3):123-37.

(C), (D), (I), (K), (L), (M) Pr. Fabrice Simon. Departamento de enfermedades infecciosas y medicina tropical. Hospital Militar de Leveran. Marsella, Francia.

(E), (G), (J) Dr. Bernard Lamey y Dr. Sophie Fite. Dermatólogos. Société Réunionnaise de Dermatologie – Groupe Nord. France. Publicado previamente en: Lamey B, Fite S. Fièvre de Chikungunya : formes cliniques et manifestations dermatologiques. Nouv. Dermatol. 2007;26 :66-74.

(F) Dr. Bernard Lamey y Dr. Sophie Fite. Dermatólogos. Société Réunionnaise de Dermatologie. Groupe Nord. Francia.

(H) Dr. Stéphanie Robin y Dr. Duksha Ramful, Servicio de Pediatría, CHR Félix Guyon, Saint-Denis de La Réunion.

Aunque la mayoría de las infecciones por CHIKV se manifiestan con fiebre y artralgias, también pueden ocurrir manifestaciones atípicas (Tabla 2). Estas manifestaciones pueden deberse a efectos directos del virus, la respuesta inmunológica frente al virus, o la toxicidad de los medicamentos.

Determinadas manifestaciones atípicas son más comunes en ciertos grupos. Por ejemplo, la meningoencefalitis y la dermatosis vesículobulosa se observan con más frecuencia en niños y lactantes, respectivamente.21, 22

Grupos de alto riesgo

El CHIKV puede afectar a mujeres y hombres de todas las edades. Sin embargo, se considera que la presentación clínica varía con la edad, siendo los individuos muy jóvenes (neonatos) y los ancianos, más propensos a desarrollar formas más graves.23-26 Además de la edad, se han identificado las comorbilidades (enfermedades subyacentes) como factores de riesgo para una evolución desfavorable.8, 23, 24, 27

En la mayoría de las infecciones por CHIKV que ocurren durante el embarazo el virus no se transmite al feto. 25, 28 Sin embargo, existen reportes puntuales de abortos espontáneos después de una infección por CHIKV en la madre.26 El riesgo más alto de transmisión parece producirse cuando la mujer está infectada en el periodo intraparto,29 momento en el que la tasa de transmisión vertical puede alcanzar un 49%. Los niños generalmente nacen asintomáticos y luego desarrollan fiebre, dolor, rash y edema periférico. Aquellos que se infectan en el periodo intraparto también pueden desarrollar enfermedad neurológica (por ej., meningoencefalitis, lesiones de la sustancia blanca, edema cerebral y hemorragia intracraneana), síntomas hemorrágicos y enfermedad del miocardio.30 Los hallazgos de laboratorio anormales incluyen pruebas de función hepática elevadas, recuentos bajos de plaquetas y linfocitos, y disminución de los niveles de protrombina. Los neonatos que sufren enfermedad neurológica generalmente desarrollan discapacidades a largo plazo.31 No hay evidencia de que el virus se transmita a través de la leche materna.25

Los adultos mayores son más propensos a experimentar enfermedad atípica grave y muerte. Los individuos >65 años presentaron una tasa de mortalidad 50 veces mayor a la de los adultos más jóvenes (<45 años).23 Aunque no está claro porque los adultos mayores tienen mas riesgo de enfermedades graves, puede deberse a que se presentan con mayor frecuencia enfermedades concomitantes subyacentes o respuestas inmunológicas disminuidas.2. 

Diagnóstico diferencial

La fiebre, con o sin artralgias, es una manifestación atribuible a muchas otras enfermedades. La CHIK puede presentarse de forma atípica o puede coexistir con otras enfermedades infecciosas como el dengue o la malaria. Las enfermedades a ser consideradas en el diagnóstico diferencial pueden variar en relación a algunas características epidemiológicas relevantes, tales como el lugar de residencia, antecedentes de viajes y exposición (Tabla 3).

Superposición y confusión con el Dengue:

Se debe distinguir la CHIK del dengue, que puede tener una evolución más tórpida, ocasionando inclusive la muerte. Ambas enfermedades pueden ocurrir al mismo tiempo en un mismo paciente. Observaciones realizadas durante brotes previos en Tailandia y la India, revelan las características principales que distinguen la CHIK del dengue. En la CHIK rara vez se observan shock o hemorragia severa; el inicio es más agudo y la duración de la fiebre es mucho menor. En la CHIK el rash maculopapular también es más frecuente que en el dengue (Tabla 4). Si bien en ambas enfermedades los pacientes pueden padecer dolor corporal difuso, el dolor es mucho más intenso y localizado en las articulaciones y tendones en la CHIK que en el dengue.

Enfermedad subaguda y crónica

Después de los primeros 10 días, la mayoría de los pacientes sentirá una mejoría en su estado general de salud y del dolor articular. Sin embargo, posteriormente puede ocurrir una reaparición de los síntomas y algunos pacientes pueden presentar síntomas reumáticos como poliartritis distal, exacerbación del dolor en articulaciones y huesos previamente lesionados, y tenosinovitis hipertrófica subaguda en muñecas y tobillos. Estos síntomas son más comunes dos o tres meses después del inicio de la enfermedad. Algunos pacientes también pueden desarrollar trastornos vasculares periféricos transitorios, tales como el síndrome de Raynaud. Además de los síntomas físicos, la mayoría de los pacientes sufrirá síntomas depresivos, fatiga general y debilidad.13

La enfermedad crónica se caracteriza por la persistencia de síntomas por más de tres meses. La frecuencia con que los pacientes reportan síntomas persistentes varía sustancialmente según el estudio y el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y el seguimiento. Estudios hechos en Sudáfrica reportan que 12%?18% de los pacientes tendrán síntomas persistentes a los 18 meses y hasta 2 a 3 años despues.35, 36 En estudios más recientes de la India, la proporción de pacientes con síntomas persistentes a los 10 meses fue de 49%.37 Datos de La Reunión encontraron que hasta 80%?93% de los pacientes experimentará síntomas persistentes 3 meses después del comienzo de la enfermedad; esta proporción disminuye a 57% a los 15 meses y a 47% a los 2 años 38, 39 (F. Simone, Dpto. de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical, Hospital Militar Laveran, Marsella, Francia, comunicación personal).

El síntoma persistente más frecuente es la artralgia inflamatoria en las mismas articulaciones que se vieron afectadas durante la etapa aguda. Generalmente no hay cambios significativos en las pruebas de laboratorio ni en las radiografías de las áreas afectadas. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan artropatía/artritis destructiva, semejante a la artritis reumatoidea o psoriásica.40 Otros síntomas o molestias durante la fase crónica pueden incluir fatiga y depresion.6 Los factores de riesgo para la persistencia de los síntomas son la edad avanzada (>65 años), los trastornos articulares preexistentes y la enfermedad aguda más severa.38, 41

Laboratorio

Tipos de pruebas de laboratorio disponibles y muestras requeridas

Para el diagnóstico de CHIK se utilizan tres tipos principales de pruebas: aislamiento viral, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) y serología. Las muestras tomadas durante la primera semana del inicio de los síntomas deben analizarse por métodos serológicos (ELISA para la detección de inmunoglobulina M [IgM] y G [IgG]) y virológicos (RT-PCR y aislamiento). Las muestras generalmente son sangre o suero, pero en casos neurológicos con características meningoencefálicas también se puede obtener líquido cefalorraquídeo (LCR). Se dispone de poca información sobre la detección del virus por aislamiento o RT-PCR a partir de tejidos u órganos.

Ante la sospecha, en casos fatales, se puede intentar la detección del virus en las muestras disponibles.

La elección de la prueba de laboratorio apropiada se basa en el origen de la muestra (humano o mosquitos recogidos en campo) y en el momento de recolección de la muestra con relación al comienzo de los síntomas (en el caso de muestras de origen humano).

Aislamiento viral

El aislamiento del virus puede realizarse a partir de mosquitos recogidos en campo o muestras de suero de la fase aguda (?8 días). El suero obtenido de la sangre total extraída durante la primera semana de la enfermedad y transportada al laboratorio en frío (entre 2°?8°C o hielo seco) lo más rápidamente posible (?48 horas) se puede inocular en una línea celular susceptible o en ratón lactante. El CHIKV producirá los efectos citopáticos típicos (ECP) dentro de los tres días posteriores a su inoculación en una variedad de líneas celulares, que incluyen células Vero, BHK-21 y HeLa. El aislamiento del virus puede realizarse en frascos de cultivo T-25 o viales shell (ver Apéndice A). Datos recientes sugieren que el aislamiento en viales shell es más sensible y produce ECP antes que el aislamiento convencional en frascos de cultivo.42 El aislamiento del CHIKV debe confirmarse ya sea por inmunofluorescencia (IF) usando antisuero específico para CHIKV, o por RT-PCR del sobrenadante del cultivo o suspensión de cerebro de ratón. El aislamiento del virus solo debe realizarse en laboratorios con nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) para reducir el riesgo de transmisión viral.

RT-PCR

Se han publicado diversas pruebas diagnósticas de RT-PCR para la detección del ARN del CHIKV. Se deben utilizar pruebas en tiempo real con sistema cerrado debido a que presentan mayor sensibilidad y menor riesgo de contaminación.

El laboratorio de diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC, utiliza de rutina la prueba publicada en el Apéndice B,43 que ha demostrado una sensibilidad de menos de 1 unidad formadora de placa (ufp) o 50 copias genómicas. Se utiliza suero obtenido de sangre total, tanto para la PCR como para el aislamiento viral.

Pruebas serológicas

Para el diagnóstico serológico se utiliza el suero obtenido de sangre total en la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y en la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT). La muestra de suero (o sangre) debe ser transportada a 2°?8°C, sin congelar. El diagnóstico serológico puede hacerse por demostración de anticuerpos IgM específicos para CHIKV o por un aumento de cuatro veces en el título de PRNT entre muestras de fase aguda y fase convaleciente. La determinación de anticuerpos IgM específicos para CHIKV se realiza mediante ELISA de captura del anticuerpo IgM (MAC-ELISA),44 seguido de PRNT (el Apéndice C muestra los protocolos detallados de ELISA IgM e IgG). Hasta el año 2010, no habían ELISAs IgM validados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) comercialmente disponibles. Se requiere PRNT para confirmar los resultados de MAC-ELISA, ya que se ha observado reactividad cruzada en MAC-ELISA con algunos miembros del serogrupo del virus Semliki Forest (SFV). La prueba de PRNT, ya sea usada para confirmar el MACELISA o para demostrar un aumento de cuatro veces entre muestras agudas/convalecientes, deberá incluir siempre otros virus del serogrupo SFV (por ej., virus Mayaro) para validar la especificidad de la reactividad. En situaciones en las que no se dispone de PRNT, se pueden utilizar otras pruebas serológicas (por ej., inhibición de la hemaglutinación [HI]) para identificar una infección reciente por un alfavirus; sin embargo, se requiere PRNT para confirmar una infección reciente por CHIKV.

Se debe recolectar suero de la fase aguda inmediatamente después del inicio de la enfermedad y suero de la fase convaleciente 10?14 días después. Generalmente se desarrolla la IgM específica para CHIKV y anticuerpos neutralizantes hacia el final de la primera semana de la enfermedad. Por lo tanto, para descartar definitivamente el diagnóstico, se deben obtener muestras de la fase convaleciente en pacientes cuyas muestras de la fase aguda fueron negativas.

Recolección, almacenamiento y transporte de muestras

La recolección, el procesamiento, el almacenamiento y el transporte adecuado de las muestras son aspectos esenciales para el diagnóstico de laboratorio.

Recolección de muestras para serología, aislamiento viral y diagnóstico molecular

Muestra: Suero

Momento de recolección: Fase aguda: durante los primeros ocho días de la enfermedad; fase convaleciente: 10?14 días después de la recolección de la muestra de la fase aguda.

Para la recolección del suero:

• Recoger de forma aséptica 4-5 mL de sangre venosa en un tubo o vial.

• Permitir que la sangre se coagule a temperatura ambiente, centrifugar a 2.000 rpm para separar el suero. Recolectar el suero en un vial limpio y seco.

• Todas las muestras clínicas deben estar acompañadas de información clínica y epidemiológica.

Otros tipos de muestras para examen de laboratorio

Muestras:

• LCR en caso de meningoencefalitis.

• Líquido sinovial en caso de artritis con derrame.

• Material de autopsia – suero o tejidos disponibles.

[Nota: Los mosquitos recogidos en campo también se manipularan usando las mismas técnicas descritas en el documento: Preparación y respuesta ante la eventual introducción del virus chikungunya en las Américas].

Transporte de muestras:

• Transportar las muestras al laboratorio a 2°?8°C (refrigerador portátil) lo más rápidamente posible.

• No congelar la sangre total, ya que la hemólisis puede interferir con los resultados de las pruebas serológicas.

• Si se prevé una demora mayor a 24 horas para el envío de las muestras al laboratorio, el suero debe separarse y conservarse refrigerado.

• Las muestras de suero para aislamiento viral y diagnóstico molecular se deben conservar congeladas (a ?20°C para almacenamiento a corto plazo o a ?70°C para almacenamiento a largo plazo).

Vigilancia de laboratorio

Antes de la identificación de CHIKV en un país, se debe llevar a cabo vigilancia de laboratorio en tres grupos de muestras: 1) muestras negativas para dengue de pacientes con dolor articular grave; 2) muestras de pacientes con enfermedad clínica compatible en áreas geográficas sin circulación activa de dengue; 3) conglomerados de pacientes con enfermedad febril y dolor articular grave. La siguiente tabla (Tabla 5) describe las pruebas idóneas para diversos contextos epidemiológicos.

Durante la introducción inicial del CHIKV en una nueva región, se deben realizar pruebas exhaustivas para confirmar que el CHIKV es el agente etiológico. Una vez identificado el CHIKV se puede considerar limitar las pruebas (no analizar todas las muestras o realizar menos tipos de pruebas) dependiendo de la capacidad del laboratorio y de la situación epidemiológica.

Interpretación y notificación de los resultados

La Figura 2 muestra la típica viremia y respuesta inmune en humanos, y la Tabla 6 describe los resultados característicos de las muestras analizadas en diferentes momentos.

Los siguientes resultados confirmarían una infección reciente por CHIKV:

• Aislamiento de CHIKV, incluyendo identificación confirmatoria (ya sea por inmunofluorescencia, RT-PCR, o secuenciación).

• Detección de ARN del CHIKV mediante RT-PCR en tiempo real.

• Identificación de un resultado positivo de IgM en un paciente con síntomas agudos de CHIK, seguido por la demostración del anticuerpo específico para CHIKV por PRNT con virus del serogrupo SFV.

• Demostración de seroconversión o incremento de cuatro veces en los títulos de PRNT, HI o ELISA (nuevamente usando otros virus del serogrupo SFV) entre las muestras obtenidas en fase aguda y convaleciente.

Los casos autóctonos deben ser reportados a la OMS, con la colaboración de un epidemiólogo, de acuerdo con el Reglamento Sanitario Internacional (RSI).

Red de laboratorios para el diagnóstico de CHIKV

Actualmente la DVBD, CDC, puede proveer de pruebas diagnósticas para la detección de infección por CHIKV. Los CDC y la Agencia de Salud Publica de Canadá pueden ofrecer reactivos y asesoramiento. Dependiendo de la disponibilidad de recursos y de la situación epidemiológica, la OPS y el CDC trabajaran en el futuro inmediato de manera conjunta para mejorar la detección del CHIKV en la Región, brindando capacitación y reactivos a los laboratorios de la red de dengue (RELDA) y otros arbovirus existentes en las Américas.

Asimismo, están previstas pruebas de proficiencia para garantizar la calidad de las pruebas diagnósticas en la Región. Se desarrollará un plan de contingencia para garantizar que todos los laboratorios de las Américas con capacidad para realizar las pruebas tengan el suministro de reactivos y los protocolos adecuados.

Apéndice A. Protocolo de aislamiento viral (para cultivo celular) (Cont.)

Introducción

El método óptimo para determinar la etiología específica de una infección por arbovirus requiere el aislamiento del virus a partir de una muestra obtenida del paciente durante la etapa aguda de la enfermedad y la demostración de un aumento en el título  de anticuerpos contra el virus aislado durante la convalecencia. Por varias razones, el aislamiento exitoso de la mayoría de los arbovirus a partir de muestras de pacientes es la excepción, ya sea porque la muestra a examinarse no se recoge a tiempo, no se manipula correctamente, o no se traslada de manera diligente al laboratorio para su inoculación. La viremia en humanos en muchas infecciones por arbovirus, si es detectable en algún momento, cesa en el momento o rápidamente después del inicio de los síntomas, una etapa en la que generalmente se puede demostrar la presencia de anticuerpos. Debido a que en la fase aguda algunos virus circulantes pueden ser recuperados y los anticuerpos pueden estar ausentes, o presentes en títulos bajos, se debe recoger la muestra de sangre de forma inmediata ante la sospecha de etiología viral. Una demora de más de una hora, puede comprometer la capacidad de aislar el virus; el tiempo aceptable depende del tipo de virus involucrado.

Ciertos arbovirus, como CHIKV, producen una viremia de magnitud y duración suficiente para permitir su aislamiento en sangre durante la fase aguda de la enfermedad, por ej., 0 a 5 días después del inicio de la enfermedad.

Se pueden obtener aislamientos virales de las vísceras obtenidas por biopsias o autopsia de pacientes con enfermedad aguda.

Para el aislamiento a partir del sistema nervioso central, las muestras deben tomarse de diversas áreas, incluyendo la corteza, los núcleos  cerebrales, el cerebelo y el tronco encefálico. Los arbovirus neurotrópicos pueden ser aislados en ocasiones a partir del LCR obtenido por punción lumbar durante las etapas agudas de la encefalitis o meningitis aséptica. Se han aislado alfavirus, como CHIKV, a partir del líquido sinovial de pacientes con poliartritis aguda. En algunas circunstancias se han recuperado arbovirus de orina, leche, semen y humor vítreo. 

Principio

Están disponibles sistemas de cultivo celulares susceptibles para intentar el aislamiento del presunto agente etiológico de la enfermedad. Después de un aislamiento exitoso, el virus puede identificarse positivamente y un antígeno preparado a partir de este aislamiento o el virus mismo pueden utilizarse para demostrar la presencia de anticuerpos contra el aislamiento viral. Si se detectan anticuerpos, se confirma que el virus aislado es el agente causal de la enfermedad. En algunos casos, el suero del  paciente puede no estar disponible. En estas circunstancias, se debe confiar en el reaislamiento del virus a partir de la muestra original. De cualquier manera se debe intentar el reaislamiento, esté disponible o no el suero del paciente.

Materiales y Reactivos

Cultivo en monocapa de células Vero u otros cultivos adecuados de células susceptibles. Cultivo de células C6/36 - células clonadas de Ae. albopictus.

Procedimiento

Se deben dividir los tejidos o líquidos disponibles para aislamiento viral, microscopía electrónica y examen inmunohistoquímico. Los tejidos deben recogerse de forma aséptica y transportarse rápidamente al laboratorio en transporte viral. La alícuota para aislamiento viral debe ser congelada inmediatamente a -70° C en congelador mecánico o almacenarse en hielo seco.

Las muestras para aislamiento viral se deben mantener congeladas continuamente, evitando los ciclos de congelamiento-descongelamiento que inactivan el virus. La alícuota para microscopía electrónica debe ser cortada muy fina y colocada  directamente en glutaraldehído. Los cambios autolíticos ocurren rápidamente, por lo que se deben fijar los tejidos cuanto antes. Una parte de la muestra debe ser fijada en formalina tamponada o, preferentemente, introducida en un medio de congelación y congelada para la preparación de cortes para el examen inmunohistoquímico.

Las muestras procesadas deben ser inoculadas en cultivos celulares cuanto antes. El suero de pacientes con enfermedad febril aguda puede ser usado sin diluir para el aislamiento del virus o en diluciones de 1:10 y 1:100 en un diluyente que contenga proteínas. Es importante inocular los especímenes desconocidos en dos o preferentemente más diluciones (sin diluir hasta 10-2). Se inoculan los viales Shell o los frascos de cultivo de 25cm2 de Vero, y se observa la producción de ECP durante 10-14 días. Para los viales shell se inocula un total de 400 ul y se centrifuga a 100x g por 1 hora a 37°C. Una parte del sobrenadante celular se puede recoger y examinar para detectar la presencia de virus ya sea por RT-PCR dirigida o RT-PCR consenso. Alternativamente se recolectan las células y se preparan portaobjetos para examen por inmunofluorescencia, usando anticuerpos monoclonales específicos tipo dengue.

Controles

Células Vero y C6/36 no inoculadas.

Interpretación

El aislamiento, reaislamiento e identificación definitiva del virus define al agente etiológico de la enfermedad del paciente. Si hay sueros pares o suero de la fase convaleciente del mismo paciente, el aislamiento viral identificado se analiza serológicamente con el suero del paciente para verificar la respuesta inmune a ese virus.

Apéndice B. Protocolo de la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa en tiempo real

La RT-PCR en tiempo real se puede realizar usando varios kits comercialmente disponibles. Actualmente en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC, se usan tanto el kit BioRad iScript 1 Step RT-qPCR (#170-8895) como el kit  QIAGEN QuantiTect Probe RT-PCR (#204443). Los dos kits son casi idénticos en la preparación de la prueba con una excepción: el volumen de enzima usado por reacción en el kit QIAGEN es 0,5 ul, en lugar de 1,0 ul; el volumen de agua de la mezcla maestra se modifica a 0,5 ul para ajustar esta diferencia. La preparación que se muestra a continuación es para el kit QIAGEN. Obsérvese también que el volumen de ARN agregado por reacción es 10 ul, pero puede incrementarse o reducirse ajustando  adecuadamente el volumen total con agua.

 

Preparar la mezcla maestra reactiva de acuerdo con el número de reacciones deseadas. La mezcla maestra se debe preparar en  n “cuarto limpio” que esté físicamente separado de todas las otras actividades del laboratorio y que tenga reactivos y  equipos exclusivos (por ej., pipetas). Para 10 muestras se debe preparar una mezcla maestra 10X (ver arriba) multiplicando los volúmenes de todos los reactivos individuales por 10. Combinar los reactivos en el orden mencionado anteriormente en un  tubo para centrífuga libre de RNasa sobre hielo. Dividir la mezcla maestra en 10 porciones de 40 ul cada una, ya sea en tubos ópticos de 0,2 ml para PCR (específicos para pruebas TaqMan; la emisión de la fluorescencia se lee a través de la tapa), o en una placa óptica de 96 pocillos para PCR. Finalmente se debe agregar 10 ul de la muestra de ARN solo a cada tubo o pocillo. Todas las pruebas se examinaran en pocillos duplicados. Incluir varios controles negativos “NO ARN” (NTC) agregando agua en  lugar de ARN. Incluir un control positivo o una serie de diluciones de cantidades conocidas de ARN con control positivo si se prepara una prueba cuantitativa.

Interpretación

El siguiente algoritmo es usado por el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC para evaluar los resultados de TaqMan. 
Positivo: • Valor de corte (Ct) menor o igual a 38 en pocillos duplicados.
Equívoco: • Ct menor o igual 38 en uno de los dos pocillos.
Negativo: • Ct mayor a 38 en pocillos duplicados.

Todas las muestras positivas y equívocas se repiten con un segundo juego de cebadores/sondas para confirmación. Un resultado positivo en cualquiera de los controles negativos invalida la corrida completa. Si el control positivo no genera un resultado  positivo también se invalida la corrida completa.

I. EXTRACCIÓN DE ARN

Evitar la contaminación al trabajar con ARN
• Mantener áreas de trabajo físicamente separadas; una debe estar dedicada al trabajo de preamplificación del ARN (extracción de ARN y agregado de ARN) y la otra a la producción de la mezcla maestra. 
• Utilizar equipo exclusivo o separado dentro de las áreas de pre y postamplificación, especialmente pipetas y centrífugas.
• Usar siempre guantes, incluso cuando se manipulan tubos sin abrir.
• Cerrar y abrir los tubos rápidamente evitando tocar cualquier parte del interior.
• Utilizar tubos y puntas de pipeta de plástico descartable libres de RNasa.
• Usar puntas de pipeta con bloqueo de aerosoles.
• Usar agua libre de RNasa.
• Preparar todos los reactivos sobre hielo.

1. Las muestras de fase sólida (mosquitos o tejidos) se homogenizan primero en un tampón isotónico para producir un homogeneizado líquido. Se extrae el ARN de las muestras líquidas (LCR o suero) sin ningún pretratamiento, como se describe más  adelante. Las muestras de tejido (~10mm3) se homogenizan en 1 ml de diluyente BA-1 usando trituradores de tejido TenBroeck. Los especímenes de mosquitos se homogenizan en trituradores de tejido TenBroeck o usando la técnica de triturado con  cuentas de acero revestidas de cobre (BB). Con ambas técnicas, los homogeneizados deben ser aclarados mediante centrifugación en una microcentrifugadora (por ej., Eppendorf) a velocidad máxima durante 5 minutos para sedimentar 
cualquier partícula.

2. Extraer el ARN de 140 ul de la muestra líquida (LCR, suero u homogeneizado aclarado) usando el kit QiAmp viral ARN (QIAGEN part # 52904). Seguir con exactitud el protocolo del fabricante. NOTA: Para especímenes de mosquitos agregar un lavado  adicional con AW1. Extraer por lo menos dos controles negativos y dos positivos junto con los especímenes de prueba. Los controles positivos deben diferir en la cantidad de ARN objetivo presente (es decir, predeterminar un positivo alto y un positivo  bajo). El volumen de la muestra extraída puede ser mayor o menor al volumen estándar especificado en el protocolo de QIAGEN (140 ?l) si se ajustan apropiadamente todos los otros volúmenes del protocolo.

Apéndice C. Protocolos de las pruebas serológicas (IgM e IgG)

PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCIÓN ENZIMÁTICA DE CAPTURA DE IgM

Introducción

Las pruebas que detectan inmunoglobulina M (IgM) viral específica son ventajosas porque ponen en evidencia anticuerpos producidos durante los primeros días del inicio de los síntomas clínicos en una infección primaria. Esto evita la necesidad de  muestras de fase convaleciente en muchos casos. La captura de IgM es el enfoque óptimo para la detección de IgM: es simple, sensible y es aplicable a muestras de suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) de una variedad de especies animales (por ej.,  humanas, equinas, aviares). Además, se minimizan las reacciones falso-positivas debido al factor reumatoide.

Principio

La prueba de inmunoabsorción enzimática de captura de anticuerpos IgM (MAC-ELISA) brinda una alternativa útil a la inmunofluorescencia para documentar la respuesta serológica. La prueba ELISA es menos subjetiva que la inmunofluorescencia y se  pueden procesar una gran cantidad de muestras. El principio es similar al de la inmunofluorescencia. El anti-IgM (el anticuerpo de captura) es revestido en placas de 96 pocillos en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC. Luego se adiciona secuencialmente el suero del paciente, y el antígeno viral conocido no infeccioso. La presencia del antígeno se detecta usando un anticuerpo antiviral acoplado a enzimas, y se genera un resultado colorimétrico a partir de la interacción entre la  enzima y un sustrato cromogénico. En esto consiste el MAC-ELISA.

Seguridad

El procedimiento debe realizarse en condiciones de laboratorio seguras, teniendo en cuenta la naturaleza potencialmente infecciosa de las muestras de suero involucradas. Se recomienda usar bata de laboratorio, guantes y campana de flujo laminar.

Materiales y Reactivos

Tampón de revestimiento: tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6. 1,59g Na2CO3 + 2,93g NaHCO3 diluido en 1L de agua.
Tampón de lavado: Tampón fosfato salino (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,2. PBS está disponible en polvo a partir de múltiples fuentes comerciales.
Tampón Bloqueante: PBS/ 5% leche/ 0,5% Tween 20.
Solución quelante: 1 N H2SO4.
Anticuerpo de revestimiento: Anti IgM humana de cabra. Laboratorios Kirkegaard y Perry cat# 01-10-03.
Antígeno viral: Antígenos virales inactivados, previamente titulados, preparados en cerebro de ratón lactante y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.
Antígeno normal: Antígenos preparados en cerebro de ratón lactante no infectado y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.
Conjugado para detección de anticuerpos: anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano, previamente titulado.

Sustrato: 3,3’,5,5’ tetrametilbencidina Base (TMB-ELISA), Gibco cat# 15980-0414.
Placas: Placas de 96 pocillos de fondo plano Immulon II HB. Dynatech Technologies cat# 3455.

Lavadora de microplacas
Lector de microplacas
Incubadora
Pipetas sencillas y multicanal
Reservorios para reactivos
Bolsas Ziploc, toallas de papel

Muestras clínicas

Especímenes de suero humano de la fase convaleciente y aguda y/o muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). Sueros humanos con anticuerpos positivos y negativos previamente testados para controles.

Nota: Almacenar todas las muestras para diagnóstico a 4°C antes de someterlas a análisis, y a -20°C luego de que se hayan completado todos los análisis previstos. Evitar ciclos repetidos de congelamientodescongelamiento.

Procedimiento

Nota: El siguiente procedimiento incluye información sobre control de calidad e interpretación de resultados. Cada muestra de suero se analiza por triplicado tanto para antígenos virales como normales. Se pueden analizar ocho muestras para estudio por placa. Las muestras de LCR generalmente se analizan individualmente.

1. Usando un marcador indeleble de punta fina, numerar y rotular las placas. Identificar la ubicación de cada muestra clínica (S1?S8) utilizando el código de laboratorio correspondiente. Para mantener los tiempos para el agregado de reactivos de manera  consistente, procesar las placas en el orden en que están numeradas durante todos los pasos del procedimiento. Las placas deben mantenerse en un ambiente cerrado y humidificado durante todo el tiempo de incubación, excepto en el paso de  revestimiento. Para ello es útil una bolsa Ziploc grande que contenga una toalla de papel húmeda.

2. Revestir los 60 pocillos internos de las placas de 96 pocillos con 75 ul por pocillo de anti IgM humana de cabra 1:2000 diluido en tampón de revestimiento pH 9,6. Incubar a 4°C durante la noche.

3. Vaciar el anticuerpo de revestimiento y secar las placas sobre toallas de papel. Bloquear las placas con 200 ul de tampón bloqueante por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

4. Lavar los pocillos 5X con tampón de lavado usando una lavadora de placas automática. Los pocillos se deben llenar completamente para cada ciclo.

5. Agregar a un bloque de seis pocillos 50 ul por pocillo del suero del paciente (S) diluido al 1:400 en tampón de lavado, o agregar el LCR del paciente sin diluir a dos pocillos solamente, para que el LCR sea examinado individualmente con los antígenos virales y normales Nota: El LCR puede ser diluido hasta un máximo de 1:5 en tampón de lavado si es necesario. Agregar suero humano de control positivo (Ref) diluido en tampón de lavado de acuerdo a la titulación previa y suero humano de control  negativo (N) diluido 1:400 en tampón de lavado a un bloque de seis pocillos cada uno. Incubar las placas por 1 hora a 37°C en cámara humidificada.

6. Lavar 5X.

7. Diluir el antígeno viral en tampón de lavado de acuerdo con la titulación previa. Agregar 50 ul por pocillo en los tres pocillos izquierdos de cada bloque de suero. A los tres pocillos derechos de cada bloque agregar 50 ul por pocillo de antígeno normal diluido en tampón de lavado en la misma concentración que el antígeno viral. Incubar durante la noche a 4°C en cámara humidificada.

8. Lavar 5X.

9. Agregar 50 ul por pocillo de anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano, con amplia reactividad cruzada para el grupo antigénico viral apropiado, diluido en tampón bloqueador, de acuerdo a la titulación previa. Incubar durante una  hora a 37°C en cámara humidificada.

10. Encender el lector de placas para que se caliente y retirar el TMB-ELISA del refrigerador

11. Lavar las placas 5X dos veces. Girar las placas 180o en la lavadora después de la primera serie de cinco ciclos. Esto promueve resultados consistentes.

12. Mientras la placa está a temperatura ambiente agregar 75ul por pocillo de sustrato TMB a todos los pocillos. Cubrir inmediatamente las placas para evitar la luz. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se desarrollará un color azul en los pocillos con anticuerpos positivos.

13. Agregar 50 ul por pocillo de solución quelante a todos los pocillos de la placa, incluyendo las hileras de pocillos exteriores (el lector de placa debe colocarse en cero en algunos de estos pocillos). Los pocillos azules se tornarán de color amarillo. Dejar reposar las placas a temperatura ambiente durante un minuto. Leer las placas en lector de placas de microtitulación usando un filtro de 450 nm.

Consideraciones prácticas

1. Las placas se pueden cubrir y conservar a 4°C hasta una semana.

2. Los sueros de control sin diluir se pueden conservar a 4°C hasta dos semanas

3. Los antígenos virales y normales reconstituidos, sin diluir pueden almacenarse a -20°C por un período de tiempo indefinido.

4. Los sueros para estudio y los de control se pueden diluir a las diluciones de trabajo y refrigerarse un día antes de usar. Los antígenos y el conjugado deben diluirse a las diluciones de trabajo inmediatamente antes de usar. La prueba MAC-ELISA se  debe reestandarizar periódicamente. Esto debería hacerse cuando se introducen nuevos números de lote de reactivos, y como mínimo, una vez al año. Se recomienda que la densidad óptica (DO) media de la reacción del suero de control positivo con el  antígeno viral se establezca en aproximadamente 1,0. La reacción del suero de control normal con el antígeno viral debe estar en alrededor de 0,2 (esto varía). Generalmente se logra la estandarización de los reactivos mediante titulación, comparando  siempre las densidades ópticas de los reactivos cuando reaccionan con el antígeno viral y normal.

Resultados

Antes de calcular los resultados de cada muestra clínica, se debe determinar que la prueba es válida. Para que una prueba se considere válida, debe cumplir lo siguiente: 


El cociente debe ser mayor o igual a 2,0. Esto es el P/N del control positivo.
Se debe determinar la validez de la prueba para cada placa. Los resultados para las muestras clínicas sólo se pueden determinar si la prueba es válida. Si la prueba no es válida, se debe repetir la placa. Si la prueba falla incluso después de una  repetición, entonces uno o más reactivos o parámetros de la prueba pueden estar equivocados y se debe buscar la solución del problema.

Para determinar si las muestras clínicas (S1-S8) contienen IgM contra el antígeno viral (lo que indicaría infección reciente por ese virus) se debe calcular lo siguiente:

Esto es el P/N de la muestra examinada. Para que una muestra se considere IgM-positiva para el virus, P/N debe ser mayor o igual a 2,0.

Además, el valor de P para la muestra examinada debe ser mayor o igual al doble de la DO media de la muestra examinada reactivada en antígeno normal. Si no se cumple con este requisito, se ha generado un entorno no específico y el resultado debe ser reportado como no interpretable.

Interpretación

Todos los valores P/N mayores o iguales a 2,0 deben reportarse como presuntos IgM-positivos (ver el párrafo siguiente), siempre que cumplan con los requisitos enumerados anteriormente. En caso de que el LCR o suero de la fase aguda temprana sean  negativos según esta prueba, se debe pedir y examinar el suero de la fase convaleciente antes de reportar a este paciente como negativo, sin evidencia serológica de infección viral reciente. Sin el examen de una muestra de la fase convaleciente, un  resultado negativo puede reflejar que la muestra de la fase aguda se obtuvo antes de que el anticuerpo haya llegado a niveles detectables. En la mayoría de los pacientes, la IgM sepuede detectar ocho días después del inicio de los síntomas de una  infección por virus del grupo alfa-, flavi-, o California. La IgM persiste por lo menos por 45 días, y generalmente hasta 90 días.

El punto de corte para el valor P/N positivo de 2,0 es empírico, en base a la experiencia y el consenso. Los valores P/N entre 2,0 y 3,0 deben considerarse como probables falso-positivos. Se deben realizar otras pruebas adicionales para confirmar el  resultado de estas muestras.

Se debe destacar que el valor P/N de una prueba a la dilución de 1:400 no es indicativa de su concentración absoluta de anticuerpos, es decir el valor P/N no es cuantitativo.

Se recomienda además que para las muestras de suero, todos los resultados positivos se confirmen mediante titulación usando 6 diluciones dobles de las muestras de suero comparándolas con una titulación similar del suero de control negativo. Las curvas de titulación lineales indican seropositividad verdadera. Las  curvas de titulación planas u ondulantes indican resultados falso-positivos.

PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCIÓN ENZIMÁTICA DE IgG

Introducción

La inmunoglobulina G (IgG) es menos específica para el virus que la IgM, aparece en suero un poco después que ésta en el curso de la infección, y permanece detectable hasta mucho después que la IgM deja de estar presente. Usando IgG-ELISA en paralelo con la prueba de Inmunoabsorción Enzimática de Captura de Anticuerpos IgM (MAC-ELISA), se pueden observar el aumento y disminución relativos de los niveles de anticuerpos en las muestras de suero pareadas. La prueba es simple y  sensible. Es aplicable a muestras de suero pero generalmente no a muestras de LCR. Las reacciones falso-positivas debido al factor reumatoide están minimizadas.

Principio

La prueba IgG-ELISA ofrece una alternativa útil frente a la inmunofluorescencia para la identificación de un aislamiento viral o para documentar la respuesta serológica. La prueba IgG-ELISA es menos subjetiva que la inmunofluorescencia y se pueden  procesar una gran cantidad de muestras. El anticuerpo monoclonal reactivo al grupo viral es recubierto en placas de 96 pocillos, seguido secuencialmente por el antígeno viral conocido, el suero del paciente, IgG humana conjugada con una enzima y  finalmente sustrato para el conjugado utilizado. En esto consiste la prueba IgG-ELISA usada en el laboratorio para el diagnóstico de arbovirus de la DVBD, CDC.

Seguridad

El procedimiento se debe realizar en condiciones de laboratorio seguras que tengan en cuenta la naturaleza potencialmente infecciosa de las muestras de suero involucradas. Se recomienda el uso de bata de laboratorio, guantes y campana de flujo  laminar.

Materiales y Reactivos

Tampón de revestimiento: Tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6, 1,59g Na2CO3 + 2,93g NaHCO3 diluido en 1L agua.

Tampón de lavado: Tampón fosfato salino (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,2. PBS disponible en polvo a partir de múltiples fuentes comerciales.

Tampón bloqueante: 3% suero de cabra, 1% Tween 20, en PBS.

Anticuerpo de revestimiento: Anticuerpo monoclonal específico de grupo, previamente titulado.

Antígeno viral: Antígenos virales inactivados, previamente titulados, preparados en cerebro de ratón lactante y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.

Antígeno normal: Antígenos preparados en cerebro de ratón lactante no infectado y extraídos mediante el método de sacarosa-acetona.

Conjugado para detección de anticuerpos: anti IgG humana de cabra porción Fc Gamma conjugada con fosfatasa alcalina, previamente titulada (Jackson Immunoresearch cat# 109-055-098).

Sustrato: 3 mg/ml p-nitrofenil fosfato, disodio (Sigma 104, Sigma diagnostics cat# 104-105) en 1M Tris (base) pH 8,0 (nota: El Tris requiere considerable conc. de HCl para el ajuste del pH).

Solución quelante: 3M NaOH.

Placas: Placas de 96 pocillos de fondo plano Immulon II HB. Dynatech Technologies cat# 3455.
Lavadora de microplacas
Lector de microplacas
Incubadora
Pipetas sencillas y multicanal
Reservorios para reactivos
Bolsas Ziploc, toallas de papel

Muestras clínicas

Sueros humanos de la fase aguda y convaleciente

Nota: Conservar todas las muestras para diagnóstico a 4°C antes de someterlas a análisis, y a -20°C después de haber completado todas las pruebas previstas. Evitar ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento.

Procedimiento

Nota: El siguiente procedimiento incluye información sobre control de calidad e interpretación de los resultados. Cada muestra de suero se examina por triplicado tanto para antígenos virales como normales. Se pueden analizar ocho muestras para estudio por placa.

1. Con un marcador indeleble de punta fina, numerar y rotular las placas. Identificar la ubicación de cada muestra clínica (S1-S8) utilizando el código de laboratorio correspondiente. Para mantener los tiempos para el agregado de reactivos de manera  consistente, procesar las placas en el orden en que están numeradas durante todos los pasos del procedimiento. Las placas deben mantenerse en un ambiente cerrado y humidificado durante todo el tiempo de incubación, excepto en el paso de  revestimiento. Para ello es útil una bolsa Ziploc grande que contenga una toalla de papel húmeda.

2. Revestir los 60 pocillos internos de las placas de 96 pocillos con 75ul por pocillo de anticuerpo monoclonal reactivo de grupo adecuado, diluido en tampón de revestimiento de acuerdo con la titulación anterior. Incubar a 4°C durante toda la noche.

3. Vaciar el anticuerpo de revestimiento y secar las placas sobre toallas de papel. Bloquear las placas con 200ul de tampón bloqueante por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

4. Lavar los pocillos 5X con tampón de lavado usando una lavadora de placas automática. Se deben llenar los pocillos completamente para cada ciclo.

5. Diluir el antígeno viral en tampón de lavado de acuerdo con la titulación previa. Agregar 50ul por pocillo en los tres pocillos izquierdos de cada bloque de sueros. A los tres pocillos de la derecha de cada bloque, agregar 50ul por pocillo de antígeno normal diluido en tampón de lavado en la misma concentración que el antígeno viral. Incubar durante la noche a 4°C en cámara humidificada.

6. Lavar 5X.

7. Agregar 50ul por pocillo del suero del paciente (S) diluido al 1:400 en tampón de lavado a un bloque de seis pocillos. Agregar suero humano de control positivo (Ref) diluido en tampón de lavado de acuerdo a la titulación previa, y un control de suero humano negativo (N) diluido 1:400 en tampón de lavado a un bloque de 6 pocillos cada uno. Incubar las placas durante una hora a 37°C en una cámara humidificada.

8. Lavar 5X.

9. Agregar 50ul por pocillo de anti IgG humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina diluida en tampón bloqueante, de acuerdo con la titulación anterior. Incubar durante una hora a 37°C en una cámara humidificada.

10. Encender el lector de placas para que se caliente y disolver las tabletas de sustrato en tampón tris aproximadamente 15 minutos antes de agregarlas a las placas.

11. Lavar las placas 5X dos veces. Gire las placas 180o en la lavadora después de la primera serie de cinco ciclos. Esto promueve resultados consistentes.

12. Mientras la placa está a temperatura ambiente, agregar 75ul por pocillo de sustrato Sigma 104 a todos los pocillos. Cubrir inmediatamente las placas para evitar la luz. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. En los pocillos con  anticuerpo positivo se desarrollará un color amarillo.

13. Agregar 35ul por pocillo de solución quelante a todos los pocillos de la placa, incluyendo las hileras externas (el lector de placa debe colocarse en cero en algunos de estos pocillos). Los pocillos reactivos continuarán de color amarillo. Dejar reposar  las placas a temperatura ambiente durante un minuto. Leer las placas en un lector de placas de microtitulacion usando un filtro de 405 nm.

Consideraciones prácticas

1. Las placas se pueden cubrir y mantener a 4°C hasta por una semana.
2. Los sueros de control sin diluir pueden conservarse a 4°C hasta por dos semanas.
3. Los antígenos virales y normales reconstituidos, sin diluir, pueden almacenarse a -20°C por un período de tiempo indefinido.
4. Los sueros para estudio y de control se pueden diluir a las diluciones de trabajo y refrigerarse un día antes de usar. Los antígenos y el conjugado deben diluirse a las diluciones de trabajo inmediatamente antes de usar.
La prueba IgG-ELISA debe reestandarizarse periódicamente. Esto debería ocurrir cuando se introducen nuevos números de lote de reactivos, y como mínimo, una vez al año. Se recomienda que la densidad óptica (DO) media de la reacción del suero de  control positivo con el antígeno viral se establezca en aproximadamente 1,0. La reacción del suero de control normal con el antígeno viral debe estar en alrededor de 0,2 (esto varía). Generalmente se logra la estandarización de los reactivos mediante  titulación, comparando siempre las densidades ópticas de los reactivos cuando reaccionan con el antígeno viral y normal.

Resultados

Antes de calcular los resultados de cada muestra clínica, se debe determinar que la prueba es válida. Para que una prueba se considere válida debe cumplir lo siguiente:

El cociente debe ser mayor o igual a 2,0. Esto es el P/N del control positivo. Se debe determinar la validez de la prueba para cada placa. Los resultados para las muestras clínicas sólo se pueden determinar si la prueba es válida. Si la prueba no es válida, se debe repetir esa placa. Si la prueba falla incluso después de una repetición, entonces uno o más reactivos o parámetros de prueba pueden estar equivocados y se debe buscar la solución del problema. Para determinar si las muestras clínicas (S1-S8) contienen IgG contra el antígeno viral (lo que indicaría infección reciente o previa con ese virus) se debe calcular lo siguiente:

Esto es el P/N de la muestra examinada. Para que una muestra sea considerada IgG-positiva para el virus, el P/N debe ser mayor o igual a 2,0.

Además, el valor de P para la muestra examinada debe ser mayor o igual al doble de la DO media de la muestra examinada reactivada en antígeno normal. Si no se cumple con este requisito, se ha generado un entorno no específico, y el resultado debe ser reportado como no interpretable.

Interpretación

Todos los valores P/N de los pacientes superiores o iguales a 2,0 deben ser reportados como presuntos IgGpositivos (ver párrafo explicativo en la siguiente página), mientras cumplan con los requisitos enumerados anteriormente. Las interpretaciones de IgG-ELISA siempre deben hacerse en el contexto del MAC-ELISA correspondiente, y la fecha de recolección de la muestra en relación con el inicio de los síntomas. Un resultado positivo de IgG-ELISA por si mismo no puede distinguir una infección reciente de una pasada, debido a la persistencia de la IgG de infecciones anteriores. La IgG también tiene una mayor reactividad cruzada que la IgM, por lo que un resultado positivo por IgG-ELISA puede en realidad indicar la presencia de anticuerpos frente a un virus relacionado. En la mayoría de los casos, la IgG se puede detectar 12 días después del inicio de los síntomas de una infección por virus del grupo alfa-, flavi-, o California y persiste por largos períodos de tiempo, posiblemente por años.

A continuación se enumeran algunos ejemplos de escenarios posibles:

1. Un resultado positivo de IgG-ELISA con un resultado positivo de MAC-ELISA indicaría la presencia de infección reciente.

2. Un resultado negativo de IgG-ELISA con un resultado positivo de MAC-ELISA en una muestra aguda indicarían una infección reciente en la cual el anticuerpo IgG todavía no ha alcanzado niveles detectables.

3. Un resultado positivo de IgG-ELISA y un resultado negativo de MAC-ELISA en una muestra tomada aproximadamente entre 8 y 45 días después del inicio de los síntomas sugeriría la ocurrencia de una infección pasada (recordar que la IgG para un  virus tiene con frecuencia reacción cruzada con otros virus del mismo género).

4. Una muestra única tardía (obtenida después de 45 días del inicio de los síntomas) que arroja un resultado positivo de IgG-ELISA y un resultado negativo de MAC-ELISA, no permite distinguir entre una infección reciente e infecciones pasadas.

5. Un resultado negativo de IgG-ELISA con un resultado negativo de MAC-ELISA indica la ausencia de infección reciente o pasada con el virus a prueba si la muestra fue tomada >7 días después del inicio de la enfermedad. En una muestra previa estos  resultados no permiten descartar la infección, dado que la respuesta inmune puede no haber tenido tiempo para desarrollarse.

El punto de corte para el valor P/N positivo de 2,0 es empírico, en base a la experiencia y el consenso. Los valores P/N entre 2,0 y 3,0 deben considerarse como probables falso-positivos. Se deben realizar otras pruebas adicionales para confirmar el  resultado de estas muestras. Se debe destacar que el valor P/N de una muestra a la dilución de examen de 1:400 no es indicativa de su concentración absoluta de anticuerpos, es decir, el valor P/N no es cuantitativo. También se recomienda que, para las  muestras de suero, todos los resultados positivos se confirmen mediante titulación usando 6 diluciones dobles de las muestras de suero, comparándolas con una titulación similar del suero de control negativo. Las curvas de titulación lineales indican seropositividad verdadera. Las curvas de titulación planas u ondulantes indican resultados falso-positivos.

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