Revista Bioreview Edición 16 - Diciembre 2012

BIODIAGNOSTICO

 

La técnica MABA (Multiple Antigen Blot Assay): una aproximación de bajo costo al diagnóstico simultáneo de múltiples enfermedades infecciosas

Oscar Noya, Sandra Losada, Marilyan Toledo, Henry Bermúdez, María A. Lorenzo, Adriana Gauna, Belkisyolé Alarcón de Noya

Secciones de Biohelmintiasis e Inmunología, Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina,Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Introducción

La presencia simultánea de distintos agentes infecciosos en un mismo individuo es la condición habitual en los seres vivos en quienes estos organismos se pueden comportar como comensales o patógenos, dependiendo del estado inmunitario del huésped. Esta situación es frecuente en los países en desarrollo y es de especial relevancia para el personal de salud que requiere conocer la exposición actual o pasada a agentes infecciosos, que pudieran estar incidiendo en la patología motivo de su consulta médica.

Más allá de resolver el problema puntual de cada paciente, debe aprovecharse la oportunidad para obtener toda la información relativa a su condición infecciosa presente o pasada que de diagnosticarse tempranamente, pudiera evitar complicaciones e inclusive la muerte. Al no aprovechar esa consulta estaríamos ante la “oportunidad perdida”, denominación frecuente entre los pediatras.

Para ello, se requiere disponer de técnicas de multi-diagnóstico que permitan identificar simultáneamente la presencia de anticuerpos contra los agentes causales, sus antígenos o sus ácidos nucleicos.

Existen, al menos, tres tecnologías disponibles y entre ellas la técnica inmunocromatográfica MABA (Multiple Antigen Blot Assay), la cual permite evaluar simultáneamente el recono-cimiento de hasta 28 antígenos diferentes, en una tira de nitrocelulosa (1,2). La plasticidad de esta técnica estriba en permitir múltiples aplicaciones más allá del diagnóstico de agentes infecciosos, como es la evaluación de antigenicidad e inmunogenicidad de antígenos crudos, recombinantes, péptidos sintéticas, alérgenos y moléculas asociadas a fenómenos de autoinmunidad, entre otras.

En el presente caso, el énfasis está orientado al diagnóstico simultáneo de enfermedades infecciosas y parasitarias, tales como esquistosomiasis, enfermedad de Chagas, leishmaniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, hepatitis viral, HIV, histoplasmosis y leptospirosis. Otros agentes microbianos están en proceso de evaluación.

La meta es que la técnica sea utilizada en los centros de salud como una prueba de tamización general, a fin de conocer el perfil serológico de los principales agentes infecciosos de cada consultante. Esta técnica es adaptable a formatos especiales (fiebres hemorrágicas, infecciones por descartar en bancos de sangre y trasplantes, mujeres embarazadas, enfermedades eruptivas de la infancia, etc.).

Materiales y métodos

Sueros de pacientes: se obtuvieron sueros de laboratorios de referencia de las diferentes enfermedades señaladas previamente, y de muestreos de poblaciones en áreas endémicas de parasitosis específicas. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participan-te en este estudio. Cada caso se evaluó con las técnicas de referencia aceptadas interna-cionalmente, parasitológicas o inmunológicas (ELISA, inmunofluorescencia indirecta y Western blot).

Antígenos: se utilizaron antígenos crudos (n=7), fracciones de los mismos (n=3) y péptidos sintéticos (n=4) obtenidos de proteínas relevantes de diferentes agentes infecciosos mediante la estrategia t-boc (3).

Metodología del MABA: se utilizó la metodología convencional de sensibilización del papel de nitrocelulosa con los diferentes antígenos con concentraciones variables entre 5 y 20 ug por ml y su revelado con sustratos luminiscentes y cromogénicos (1,2). El registro y el análisis cualitativo y cuantitativo se realizó TMcon un analizador de imágenes (Chemidoc, BioRAD). Hasta ahora, el MABA ha sido utilizado como un método cualitativo, pero al utilizar el analizador de imágenes se convierte en una herramienta que permite el análisis cuantitativo del reconocimiento a las moléculas antigénicas en evaluación.

La sensibilidad y la especificidad de cada uno de los antígenos se estableció de forma individual al comparar los resultados de cada antígeno, con las pruebas de referencia.

Resultados y Conclusiones

La sensibilidad y la especificidad obtenidas con los diferentes antígenos evaluados en esta serie fue variable ya que dependió de cada antígeno. De forma sucinta, los resultados obtenidos hasta ahora, muestran sensibilidades superiores al 75%, teniendo sólo problemas con la especificidad correspondiente a los antígenos de Toxocara canis, Histoplasma capsulatum y Leptospira spp. que  no se han podido minimizar eliminando los epítopos “glicosilados” con metaperiodato de sodio.

En cuanto al costo de evaluación de cada antígeno y tomando sólo en cuenta los materiales, es de US$ 0,07 para MABA frente a US$ 0,114 para la técnica de ELISA convencional. Si se añadiera el costo del personal, al realizarse en el caso del MABA en un tiempo comparable al de un solo agente causal por ELISA, el costo final dependería del número de antígenos incluidos en MABA, siendo significativamente menor que la prueba de ELISA, que es considerada la más económica de las técnicas de inmuno-diagnóstico.

Con el fin de ajustar el método a un sistema automatizable, se ha iniciado la exposición de los sueros de forma cruzada utilizando el TMMiniblotter, bajo un formato que deno-minamos “Cross-MABA”, el cual mantiene las mismas cualidades del MABA convencional, pero es más simple y rápida su ejecución, ya que no requiere el corte ni la manipulación de las tiras del papel de nitrocelulosa.

En conclusión, se reafirman las virtudes de una técnica aplicable en diferentes formatos y en diferentes instituciones de salud y las limitaciones observadas con algunos antígenos, como el de T. canis, que requiere la preadsorción de los sueros con antígeno de Ascaris suum, debido a la alta reactividad cruzada del mismo, que no permite su aplicación para estudios de poblaciones, pero sí para el diagnóstico individual de los casos de toxocariasis.

La alta especificidad y sensibilidad obtenida con los antígenos de Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Fasciola hepática, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, cisticerco de Taenia solium y péptidos de los virus HIV y VHC los reafirma para futuros estudios. Deben mejorarse algunos péptidos de HIV, S. mansoni y los antígenos crudos de Histoplasma capsulatum, Toxocara canis, Leptospira spp. y Leishmania mexicana.

La simplificación y el análisis cuantitativo mediante su registro por el analizador de imágenes, permiten un análisis más objetivo de los resultados y más factible de establecerse como un sistema automatizado, fácilmente adaptable a diferentes formatos y a los requerimientos de la demanda del sector salud.

Financiado por: Proyecto Multidiagnóstico (Proyecto No. UCV-G-2005000387), Misión Ciencia del FONACIT (Subproyecto 1-Proyecto No. 2007001425), Venezuela.

 

Referencias Bibliográficas

1.Noya O, Alarcón de Noya B. The multiple antigen blot assay (MABA): a simple immunoenzymatic technique for simultaneous scrreening of multiple antigens. Immunol Letters. 1998;63:53-6.

2. Noya O, Losada S, Toledo M, Alarcón de Noya B. The multiple antigen blot assay-MABA, a simple, versatile and multi-purpose immunoenzymatic technique. En: Protein blotting. Methods in molecular biology. New York: The Humana Press Inc., The Humana Press: 2009. p. 237-51.

Introducción

La presencia simultánea de distintos agentes infecciosos en un mismo individuo es la condición habitual en los seres vivos en quienes estos organismos se pueden comportar como comensales o patógenos, dependiendo del estado inmunitario del huésped. Esta situación es frecuente en los países en desarrollo y es de especial relevancia para el personal de salud que requiere conocer la exposición actual o pasada a agentes infecciosos, que pudieran estar incidiendo en la patología motivo de su consulta médica.

Más allá de resolver el problema puntual de cada paciente, debe aprovecharse la oportunidad para obtener toda la información relativa a su condición infecciosa presente o pasada que de diagnosticarse tempranamente, pudiera evitar complicaciones e inclusive la muerte. Al no aprovechar esa consulta estaríamos ante la “oportunidad perdida”, denominación frecuente entre los pediatras.

Para ello, se requiere disponer de técnicas de multi-diagnóstico que permitan identificar simultáneamente la presencia de anticuerpos contra los agentes causales, sus antígenos o sus ácidos nucleicos.

Existen, al menos, tres tecnologías disponibles y entre ellas la técnica inmunocromatográfica MABA (Multiple Antigen Blot Assay), la cual permite evaluar simultáneamente el recono-cimiento de hasta 28 antígenos diferentes, en una tira de nitrocelulosa (1,2). La plasticidad de esta técnica estriba en permitir múltiples aplicaciones más allá del diagnóstico de agentes infecciosos, como es la evaluación de antigenicidad e inmunogenicidad de antígenos crudos, recombinantes, péptidos sintéticas, alérgenos y moléculas asociadas a fenómenos de autoinmunidad, entre otras.

En el presente caso, el énfasis está orientado al diagnóstico simultáneo de enfermedades infecciosas y parasitarias, tales como esquistosomiasis, enfermedad de Chagas, leishmaniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, hepatitis viral, HIV, histoplasmosis y leptospirosis. Otros agentes microbianos están en proceso de evaluación.

La meta es que la técnica sea utilizada en los centros de salud como una prueba de tamización general, a fin de conocer el perfil serológico de los principales agentes infecciosos de cada consultante. Esta técnica es adaptable a formatos especiales (fiebres hemorrágicas, infecciones por descartar en bancos de sangre y trasplantes, mujeres embarazadas, enfermedades eruptivas de la infancia, etc.).

Materiales y métodos

Sueros de pacientes: se obtuvieron sueros de laboratorios de referencia de las diferentes enfermedades señaladas previamente, y de muestreos de poblaciones en áreas endémicas de parasitosis específicas. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participan-te en este estudio. Cada caso se evaluó con las técnicas de referencia aceptadas interna-cionalmente, parasitológicas o inmunológicas (ELISA, inmunofluorescencia indirecta y Western blot).

Antígenos: se utilizaron antígenos crudos (n=7), fracciones de los mismos (n=3) y péptidos sintéticos (n=4) obtenidos de proteínas relevantes de diferentes agentes infecciosos mediante la estrategia t-boc (3).

Metodología del MABA: se utilizó la metodología convencional de sensibilización del papel de nitrocelulosa con los diferentes antígenos con concentraciones variables entre 5 y 20 ug por ml y su revelado con sustratos luminiscentes y cromogénicos (1,2). El registro y el análisis cualitativo y cuantitativo se realizó TMcon un analizador de imágenes (Chemidoc, BioRAD). Hasta ahora, el MABA ha sido utilizado como un método cualitativo, pero al utilizar el analizador de imágenes se convierte en una herramienta que permite el análisis cuantitativo del reconocimiento a las moléculas antigénicas en evaluación.

La sensibilidad y la especificidad de cada uno de los antígenos se estableció de forma individual al comparar los resultados de cada antígeno, con las pruebas de referencia.

Resultados y Conclusiones

La sensibilidad y la especificidad obtenidas con los diferentes antígenos evaluados en esta serie fue variable ya que dependió de cada antígeno. De forma sucinta, los resultados obtenidos hasta ahora, muestran sensibilidades superiores al 75%, teniendo sólo problemas con la especificidad correspondiente a los antígenos de Toxocara canis, Histoplasma capsulatum y Leptospira spp. que  no se han podido minimizar eliminando los epítopos “glicosilados” con metaperiodato de sodio.

En cuanto al costo de evaluación de cada antígeno y tomando sólo en cuenta los materiales, es de US$ 0,07 para MABA frente a US$ 0,114 para la técnica de ELISA convencional. Si se añadiera el costo del personal, al realizarse en el caso del MABA en un tiempo comparable al de un solo agente causal por ELISA, el costo final dependería del número de antígenos incluidos en MABA, siendo significativamente menor que la prueba de ELISA, que es considerada la más económica de las técnicas de inmuno-diagnóstico.

Con el fin de ajustar el método a un sistema automatizable, se ha iniciado la exposición de los sueros de forma cruzada utilizando el TMMiniblotter, bajo un formato que deno-minamos “Cross-MABA”, el cual mantiene las mismas cualidades del MABA convencional, pero es más simple y rápida su ejecución, ya que no requiere el corte ni la manipulación de las tiras del papel de nitrocelulosa.

En conclusión, se reafirman las virtudes de una técnica aplicable en diferentes formatos y en diferentes instituciones de salud y las limitaciones observadas con algunos antígenos, como el de T. canis, que requiere la preadsorción de los sueros con antígeno de Ascaris suum, debido a la alta reactividad cruzada del mismo, que no permite su aplicación para estudios de poblaciones, pero sí para el diagnóstico individual de los casos de toxocariasis.

La alta especificidad y sensibilidad obtenida con los antígenos de Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Fasciola hepática, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, cisticerco de Taenia solium y péptidos de los virus HIV y VHC los reafirma para futuros estudios. Deben mejorarse algunos péptidos de HIV, S. mansoni y los antígenos crudos de Histoplasma capsulatum, Toxocara canis, Leptospira spp. y Leishmania mexicana.

La simplificación y el análisis cuantitativo mediante su registro por el analizador de imágenes, permiten un análisis más objetivo de los resultados y más factible de establecerse como un sistema automatizado, fácilmente adaptable a diferentes formatos y a los requerimientos de la demanda del sector salud.

Financiado por: Proyecto Multidiagnóstico (Proyecto No. UCV-G-2005000387), Misión Ciencia del FONACIT (Subproyecto 1-Proyecto No. 2007001425), Venezuela.

 

CERRAR
BIODIAGNOSTICO
» Abrir toda la revista
Bioquímica Molecular +- Diagnóstico Clínico Aplicado +- Gestión de la Calidad +- Actualidad +- Bioresearch +- Novedades CUBRA +- Agenda de formación continua y posgrado »