Revista Bioreview Edición 16 - Diciembre 2012

BIODIAGNOSTICO

 

Uso de herramientas moleculares en el diagnóstico de parasitosis: PCR en tiempo real, iniciativas en enfermedad de Chagas

M. M. C. Bisio1, C. Cura1, T. Duffy1, M. Sued2, Y. Qvarnstrom3, A. Da Silva3, L. Orellana2, A. G.  Schijman1

(1) Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, Instituto de Ingeniería Genética y Biología Molecular-CONICET, Buenos Aires, Argentina

(2) Instituto de Cálculo, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

(3) Division of Parasitic Diseases and Malaria, Center for Global Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA.

Evaluación internacional de métodos de PCR para diagnóstico de Trypanosoma cruzi

En un consorcio formado por INGEBI-CONICET, (CeNDIE) ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán; CIMPAT, Universidad de los Andes (Bogotá, Colombia), Laboratorio de Biología Molecular e Doenças Endêmicas, Instituto Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brasil) y Laboratorio de Serodiagnóstico para Enfermedad de Chagas, Universidade Federal de Goias (Goiania, Brasil), con el apoyo de WHO-TDR y PAHO, organizamos un estudio multicéntrico para evaluar protocolos de PCR para diagnóstico molecular de infección por Trypanosoma cruzi.

En este estudio intervinieron 29 centros y laboratorios de Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Guyana Francesa, México, Perú, Venezuela, Uruguay, Estados Unidos, España, Bélgica, Francia y Reino Unido. A cada uno de ellos se les enviaron tres paneles de muestras a ciegas (n= 70) para que sean procesadas siguiendo sus métodos de rutina: un panel formado por diluciones seriadas de ADN de cepas de referencia de T. cruzi, X-10 (Tc I), Cl Brener (Tc VI) y CAN III (Tc IV) y controles negativos, otro panel formado por sangre no infectada contaminada con diluciones de parásitos de cultivo y un tercer panel formado por muestras seropositivas y seronegativas de individuos de Argentina, Bolivia y Brasil.

Se informaron 48 métodos de PCR por 27 laboratorios participantes, usando como blancos moleculares secuencias de minicírculo, ADN satélite, ARN ribosómico, secuencias del miniexón y mitocondriales, usando termociclados convencionales o PCR en tiempo real. De este estudio multicéntrico se seleccionaron cuatro métodos de PCR que arrojaron los mejores resultados de especificidad y sensibilidad en los tres paneles, entre ellos dos métodos de PCR en tiempo real dirigidos a secuencias de ADN satélite, uno revelado por Sybr Green y el otro empleando la sonda TaqMan (Schijman, et al., 2011).

En primer lugar, se evaluó la reproducibilidad de estos métodos en el Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas en INGEBI, mediante un experimento en el cual cuatro operadores distintos evaluaron a ciegas, las mismas ocho muestras (muestras positivas con diferente nivel de parasitemia y muestras no infectadas), confirmándose el desempeño obtenido en el estudio multicéntrico (Schijman, et al., 2011).

En el marco de un taller realizado en INGEBI con financiación de TDR y UNU-BIOLAC en noviembre de 2008, 18 operadores representantes de los laboratorios participantes en el ensayo multicéntrico, manipularon un panel de muestras con distinta carga parasitaria y evaluaron la sensibilidad y la especificidad de la PCR en tiempo real revelada con SybrGreen. La especificidad y sensibilidad de esta PCR en tiempo real fue de 88% y 100%, respectiva-mente cuando la extracción del ADN había sido por solventes orgánicos y de 100% y 78%, respectivamente cuando la extracción fue por columna de sílica gel. El taller permitió definir mejores prácticas de PCR y armonizar los procedimientos y controles de calidad entre todos los laboratorios interesados.

Determinación de la carga parasitaria por PCR en tiempo real

Hemos desarrollado un sistema cuantitativo de PCR en tiempo real para determinar la carga parasitaria en muestras de sangre periférica usando como blanco molecular la secuencia satélite e iniciadores modificados para aumentar la capacidad de reconocimiento de los distintos linajes parasitarios. Para mejorar la precisión de la cuantificación hemos incorporado al ensayo un plásmido recombinante lineal como estándar interno (IAC) que se agrega a la muestras de sangre original y se utiliza para normalizar el valor crudo de la carga parasitaria, según el rendimiento de la extracción de ADN de la muestra sanguínea y la eficiencia de amplificación (Duffy, et al., 2009).

Este procedimiento fue ensayado en el seguimiento de 38 pacientes pediátricos en tratamiento con benznidazol. También fue usado para seguir la dinámica de la parasitemia en pacientes sometidos a trasplante cardiaco con riesgo de reactivación por inmunosupresión. Esta metodología fue evaluada en estudios con muestras de tejido en modelo experimental (Zago, et al., 2008) y actualmente en pacientes con trasplante renal.

Actualmente, se realizan ensayos para evaluar la precisión de la PCRq, según las recomendaciones del Clinical and Laboratory Estándar Institute de Estados Unidos (CLSI, 2004) utilizando sondas TaqMan en versión múltiple, que incluye la amplificación simultánea del IAC, para poder ser utilizada en los procesos de validación como marcador de eficacia en la respuesta parasitológica durante los estudios de nuevos fármacos candidatos (Convenio CONICET-Drug and Neglected Diseases Initiative, Médicos sin Fronteras).

Asimismo, en julio de 2011 se lanzará una iniciativa para la armonización y validación multicéntrica de técnicas de PCR en tiempo real para determinar la carga parasitaria en pacientes con Chagas crónico, lanzada por la Organización Panamericana de la Salud.

Detección de unidades discretas de tipificación de Trypanosoma cruzi por PCR múltiple en tiempo real con sondas TaqMan

Se diseñó un algoritmo de PCR múltiple para discriminar entre las seis unidades de tipificación discreta de T. cruzi (UDT), denominadas TcI a TcVI en el marco de un consenso alcanzado en el segundo simposio satélite de nomenclatura de T. cruzi en Buzios, Brasil, en agosto de 2009 (Zingales, et al., 2009). Se diseñaron iniciadores y sondas TaqMan hacia la región intergénica del miniexón hacia genes para ARN ribosómico 18S y secuencia codificantes de la citocromo oxidasa II mitocondrial, en base al alineamiento de secuencias disponibles en GeneBank. Hasta el momento se estandarizó la PCR múltiple para secuencias intergénicas de miniexón, que permite distinguir Tc1, Tc II/V/VI, Tc III y Tc IV (Duffy, 2010). Esta estrategia fue evaluada con 27 stocks de referencia, provenientes de Argentina, Chile, Brasil, Colombia, México y Estados Unidos, pertenecientes a las seis UDT.

Con esta metodología se han caracterizado 31 aislamientos naturales de T. cruzi de triatominos silvestres (Triatoma gerstaeckeri, T. protacta, T. indictiva, T. sanguisuga y T. lecticularia), aislamientos de reservorios silvestres del sur de Estados Unidos, 4 de ellos compuestos por infecciones mixtas de Tc I y Tc IV y muestras clínicas de pacientes con reactivación de la enfermedad de Chagas por inmunosupresión posterior a trasplante de órganos, y se encontró Tc I y Tc V en chagomas epidérmicos de pacientes argentinos.

Financiación: PICT 33955, Agencia Nacional de Ciencia y Tecnología, PIP 112-2008-01-02915, CONICET.

 

Referencias Bibliográficas

1.CLSI/NCCLS. Evaluation of precision performance of quantitative methods; Approved guideline. Second edition. CLSI document EP5-A2; 2004.

2. Duffy T, Bisio, M, Burgos JM, Díez M, Levin MJ, Favaloro RR, et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in Chagas disease patients. PLoS Negl Trop Dis. 2009;3:1-10.

3. Duffy T. Búsqueda y caracterización de marcadores moleculares para identificación de linajes de T. cruzi en vectores, reservorios animales y pacientes infectados (tesis). Buenos Aires: Universidad de Buenos Aires; 2010.

4. Schijman AG, Bisio M, Orellana L, Sued M, Duffy T, Mejía-Jaramillo AM, et al. International study to evaluate PCR methods for detection of Trypanosoma cruzi DNA in blood samples from Chagas disease patients. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e931.

5. Zago MP, Barrio AB, Cardozo RM, Duffy T, Schijman AG, Basombrío MA. Impairment of infectivity and immunoprotective effect of a LYT1 null mutant of Trypanosoma cruzi. Infect Immun. 2008;76:443-51.

6. Zingales B, Andrade SG, Briones MR, Campbell DA, Chiari E, Fernández O, et al. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009;104:1051-4.

Evaluación internacional de métodos de PCR para diagnóstico de Trypanosoma cruzi

En un consorcio formado por INGEBI-CONICET, (CeNDIE) ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán; CIMPAT, Universidad de los Andes (Bogotá, Colombia), Laboratorio de Biología Molecular e Doenças Endêmicas, Instituto Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brasil) y Laboratorio de Serodiagnóstico para Enfermedad de Chagas, Universidade Federal de Goias (Goiania, Brasil), con el apoyo de WHO-TDR y PAHO, organizamos un estudio multicéntrico para evaluar protocolos de PCR para diagnóstico molecular de infección por Trypanosoma cruzi.

En este estudio intervinieron 29 centros y laboratorios de Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Guyana Francesa, México, Perú, Venezuela, Uruguay, Estados Unidos, España, Bélgica, Francia y Reino Unido. A cada uno de ellos se les enviaron tres paneles de muestras a ciegas (n= 70) para que sean procesadas siguiendo sus métodos de rutina: un panel formado por diluciones seriadas de ADN de cepas de referencia de T. cruzi, X-10 (Tc I), Cl Brener (Tc VI) y CAN III (Tc IV) y controles negativos, otro panel formado por sangre no infectada contaminada con diluciones de parásitos de cultivo y un tercer panel formado por muestras seropositivas y seronegativas de individuos de Argentina, Bolivia y Brasil.

Se informaron 48 métodos de PCR por 27 laboratorios participantes, usando como blancos moleculares secuencias de minicírculo, ADN satélite, ARN ribosómico, secuencias del miniexón y mitocondriales, usando termociclados convencionales o PCR en tiempo real. De este estudio multicéntrico se seleccionaron cuatro métodos de PCR que arrojaron los mejores resultados de especificidad y sensibilidad en los tres paneles, entre ellos dos métodos de PCR en tiempo real dirigidos a secuencias de ADN satélite, uno revelado por Sybr Green y el otro empleando la sonda TaqMan (Schijman, et al., 2011).

En primer lugar, se evaluó la reproducibilidad de estos métodos en el Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas en INGEBI, mediante un experimento en el cual cuatro operadores distintos evaluaron a ciegas, las mismas ocho muestras (muestras positivas con diferente nivel de parasitemia y muestras no infectadas), confirmándose el desempeño obtenido en el estudio multicéntrico (Schijman, et al., 2011).

En el marco de un taller realizado en INGEBI con financiación de TDR y UNU-BIOLAC en noviembre de 2008, 18 operadores representantes de los laboratorios participantes en el ensayo multicéntrico, manipularon un panel de muestras con distinta carga parasitaria y evaluaron la sensibilidad y la especificidad de la PCR en tiempo real revelada con SybrGreen. La especificidad y sensibilidad de esta PCR en tiempo real fue de 88% y 100%, respectiva-mente cuando la extracción del ADN había sido por solventes orgánicos y de 100% y 78%, respectivamente cuando la extracción fue por columna de sílica gel. El taller permitió definir mejores prácticas de PCR y armonizar los procedimientos y controles de calidad entre todos los laboratorios interesados.

Determinación de la carga parasitaria por PCR en tiempo real

Hemos desarrollado un sistema cuantitativo de PCR en tiempo real para determinar la carga parasitaria en muestras de sangre periférica usando como blanco molecular la secuencia satélite e iniciadores modificados para aumentar la capacidad de reconocimiento de los distintos linajes parasitarios. Para mejorar la precisión de la cuantificación hemos incorporado al ensayo un plásmido recombinante lineal como estándar interno (IAC) que se agrega a la muestras de sangre original y se utiliza para normalizar el valor crudo de la carga parasitaria, según el rendimiento de la extracción de ADN de la muestra sanguínea y la eficiencia de amplificación (Duffy, et al., 2009).

Este procedimiento fue ensayado en el seguimiento de 38 pacientes pediátricos en tratamiento con benznidazol. También fue usado para seguir la dinámica de la parasitemia en pacientes sometidos a trasplante cardiaco con riesgo de reactivación por inmunosupresión. Esta metodología fue evaluada en estudios con muestras de tejido en modelo experimental (Zago, et al., 2008) y actualmente en pacientes con trasplante renal.

Actualmente, se realizan ensayos para evaluar la precisión de la PCRq, según las recomendaciones del Clinical and Laboratory Estándar Institute de Estados Unidos (CLSI, 2004) utilizando sondas TaqMan en versión múltiple, que incluye la amplificación simultánea del IAC, para poder ser utilizada en los procesos de validación como marcador de eficacia en la respuesta parasitológica durante los estudios de nuevos fármacos candidatos (Convenio CONICET-Drug and Neglected Diseases Initiative, Médicos sin Fronteras).

Asimismo, en julio de 2011 se lanzará una iniciativa para la armonización y validación multicéntrica de técnicas de PCR en tiempo real para determinar la carga parasitaria en pacientes con Chagas crónico, lanzada por la Organización Panamericana de la Salud.

Detección de unidades discretas de tipificación de Trypanosoma cruzi por PCR múltiple en tiempo real con sondas TaqMan

Se diseñó un algoritmo de PCR múltiple para discriminar entre las seis unidades de tipificación discreta de T. cruzi (UDT), denominadas TcI a TcVI en el marco de un consenso alcanzado en el segundo simposio satélite de nomenclatura de T. cruzi en Buzios, Brasil, en agosto de 2009 (Zingales, et al., 2009). Se diseñaron iniciadores y sondas TaqMan hacia la región intergénica del miniexón hacia genes para ARN ribosómico 18S y secuencia codificantes de la citocromo oxidasa II mitocondrial, en base al alineamiento de secuencias disponibles en GeneBank. Hasta el momento se estandarizó la PCR múltiple para secuencias intergénicas de miniexón, que permite distinguir Tc1, Tc II/V/VI, Tc III y Tc IV (Duffy, 2010). Esta estrategia fue evaluada con 27 stocks de referencia, provenientes de Argentina, Chile, Brasil, Colombia, México y Estados Unidos, pertenecientes a las seis UDT.

Con esta metodología se han caracterizado 31 aislamientos naturales de T. cruzi de triatominos silvestres (Triatoma gerstaeckeri, T. protacta, T. indictiva, T. sanguisuga y T. lecticularia), aislamientos de reservorios silvestres del sur de Estados Unidos, 4 de ellos compuestos por infecciones mixtas de Tc I y Tc IV y muestras clínicas de pacientes con reactivación de la enfermedad de Chagas por inmunosupresión posterior a trasplante de órganos, y se encontró Tc I y Tc V en chagomas epidérmicos de pacientes argentinos.

Financiación: PICT 33955, Agencia Nacional de Ciencia y Tecnología, PIP 112-2008-01-02915, CONICET.

 

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