Revista Bioreview Edición 3 - Noviembre 2011

BIODIAGNOSTICO
LABORATORIO DE MEDICINA

 

Ensayos tiroideos para el bioquímico y el médico

Liliana M. Bergoglio, Bioquímica Endocrinóloga, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina. E-mail: liberg@uolsinectis.com.ar

Jorge H. Mestman, Médico Endocrinólogo, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, Estados Unidos NACB: Guía de Consenso para el

Diagnóstico y Seguimiento de la Enfermedad Tiroidea Fuente: Revista Argentina de Endocrinología y Metabilismo, Vol 42, N° 2, Año 2005.

Mencionamos con reconocimiento los nombres de los profesionales que participaron en la revisión de la traducción del documento original sobre el cual está basada esta monografía:

Claudio Aranda, Hospital Carlos C. Durand, Buenos Aires, Argentina Aldo H. Coleoni, Universidad Nacional de Córdoba,Córdoba, Argentina.

N. Liliana F. de Muñoz, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba, Argentina.

Silvia Gutiérrez, Hospital Carlos C. Durand, Buenos Aires,Argentina H. Rubén Harach, Hospital Dr. A. Oñativia, Salta,Argentina.

Gustavo C. Maccallini, Hospital Carlos C. Durand, Buenos Aires,Argentina.

Mirta B. Miras, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad,Córdoba, Argentina.

Hugo Niepomniszcze, Universidad Nacional de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.

Adriana Oneto, Hospital Carlos C. Durand, Buenos Aires, Argentina.

Eduardo Pusiol, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza,Argentina.

Gerardo C. Sartorio, Hospital J. M. Ramos Mejía, Buenos Aires,Argentina.


A. Métodos para determinar Tiroxina Total (T4T) y Triyodotironina Total (T3T)

La tiroxina (T4) es la principal hormona secretada por la glándula tiroides. Toda la T4 circulante deriva de la secreción tiroidea. Por el contrario, sólo aproximadamente el 20% de la triyodotironina (T3) circulante es de origen tiroideo. La mayor parte de la T3 circulante se produce por acción enzimática en tejidos no tiroideos por la 5' monodeyodinación de la T4 (121). En efecto, la T4 aparece como una prohormona de la T3, biológicamente más activa.

La mayor parte de la T4 circulante (~99,98%) está ligada a proteínas plasmáticas de transporte específicas : la globulina transportadora detiroxina (TBG) (60-75%), la TTR/TBPA (transtiretina/prealbúmina) (15-30%) y la albúmina (~10%) (12,16).
Aproximadamente el 99,7% de la T3 circulante está unida a las proteínas plasmáticas, específicamente a la TBG, con una afinidad diez veces menor que la observada para la T4 (12).

Las hormonas tiroideas unidas a proteínas no ingresan a las células y, por lo tanto, se las considera biológicamente inertes, y funcionan como reservorios para la hormona tiroidea circulante.Por el contrario, las pequeñas fracciones de hormona libre penetran fácilmente en las células mediante mecanismos específicos de transporte a través de la membrana para ejercer sus efectos biológicos.

En la hipófisis, el mecanismo de retroalimentación negativo de las hormonas tiroideas sobre la secreción de TSH está mediado principalmente por la T3 producida in situ a partir de la T4 libre que entra en las células tirotróficas.

Técnicamente, ha sido más fácil desarrollar métodos para medir las concentraciones de hormonas tiroideas totales (libres + unidas a proteínas), que estimar las pequeñas concentraciones de hormonas libres.

Esto se debe a que las concentraciones de hormonas totales (T4T y T3T) se determinan a niveles nanomolares mientras que las concentraciones de hormonas libres (T4L y T3L) se miden en el rango de picomoles, y para ser válidas, esas mediciones deben estar libres de interferencia por las concentraciones mucho más altas de hormonas totales.

1.Métodos para la determinación de hormonas tiroideas totales

Los métodos para determinar T4T y T3T séricas han evolucionado a través de diversas tecnologías durante las últimas cuatro décadas.

Los ensayos de PBI, de la década del 50 que estimaban la concentración de T4T como “yodo unido a proteínas” fueron reemplazados en la década del 60, primero por métodos competitivos utilizando proteínas ligantes, y posteriormente en la década del 70 por métodos de radioinmunoensayo (RIA).

Actualmente, las concentraciones de T4T y T3T se miden por inmunoensayos competitivos que son principalmente no isotópicos y que usan enzimas , moléculas f luorescentes o quimioluminiscentes como señales (135). Los métodos para hormonas totales requieren la inclusión de un inhibidor (agente desplazante o bloqueante) como el ácido 8-anilino-1-naftaleno-sulfónico (ANS) o el salicilato para liberar la hormona de las proteínas transportadoras (136). El desplazamiento por parte de estos agentes de la unión de la hormona a las proteínas transportadoras, junto con la gran dilución de la muestra utilizada en los ensayos modernos, facilita la unión de la hormona al anticuerpo.

La determinación de T3T en una concentración diez veces menor en sangre, comparada con la de T4T, representa desafíos técnicos de sensibilidad y de precisión, a pesar del uso de mayores volúmenes de muestra (137). Si bien una determinación de T3 confiable en el rango alto es crítica para el diagnóstico de hipertiroidismo, también lo es una determinación confiable en el rango normal para ajustar la dosis de los fármacos antitiroideos, y detectar hipertiroidismo en pacientes enfermos hospitalizados, que pueden tener un valor paradójicamente normal de T3.

A pesar de la disponibilidad de preparaciones altamente purificadas de L-tiroxina y Ltriyodotironina cristalizadas (de la United States Pharmacopoeia (16201 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852) aún no se han establecido métodos de referencia para T4T ni T3T (138,139). La naturaleza higroscópica de las preparaciones cristalinas puede afectar la exactitud de la medición gravimétrica (140). En segundo lugar, los diluyentes utilizados para reconstituir las preparaciones de L-T4 y L-T3 que se usarán como calibradores son matrices proteicas modificadas o mezclas de sueros humanos a los que se les ha extraído la hormona. En cualquier caso, la composición proteica de la matriz de los calibradores no es idéntica a la del suero del paciente. Esto puede provocar que el inhibidor de la unión a proteínas (por ejemplo el ANS) libere diferentes cantidades de hormona de las proteínas del calibrador que de la TBG en la muestra del paciente. Esto puede afectar la exactitud diagnóstica del ensayo cuando las proteínas transportadoras son anormales, como en las NTI.

Recomendación Nº 9. Para los fabricantes que desarrollan métodos de T4T y de T3T

Las divergencias entre métodos deberían reducirse por:

*El desarrollo de preparaciones de referencia de L-T4 y LT3 y el establecimiento de métodos de referencia internacionales.

*Asegurar que los instrumentos de medición no sean sensibles a las diferencias  entre el suero humano y la matriz del calibrador.

*Asegurar que durante el proceso del ensayo, la cantidad de hormona tiroidea  liberada de las proteínas transportadoras séricas sea la misma que la liberada en  presencia del diluyente del calibrador.

2. Exactitud diagnóstica de las determinaciones de hormonas totales

La exactitud diagnóstica de las determinaciones de hormonas tiroideas totales sería igual a la de las hormonas libres si todos los pacientes tuvieran niveles idénticos de proteínas transportadoras (TBG, TTR/TBPA y albúmina) con afinidades similares para las hormonas
tiroideas. Lamentablemente, es más común que se presenten alteraciones en las concentraciones de T4T y T3T debido a alteraciones en las proteínas transportadoras, que debido a una verdadera disfunción tiroidea. En la práctica clínica resulta frecuente encontrar pacientes con alteraciones en la TBG secundarias a embarazo o tratamiento con estrógenos, como así también alteraciones genéticas (141). Las concentraciones y/o las afinidades anormales de la TBG por las hormonas tiroideas pueden distorsionar la relación entre las concentraciones de hormona total y libre (142).

Además, algunos sueros de pacientes contienen otras proteínas ligantes anormales, como los auto-anticuerpos anti-hormonas tiroideas, que
afectan la confiabi-lidad diagnóstica de las determinaciones de hormonas totales (143-145). Estas alteraciones en las proteínas transportadoras comprometen el uso de las determinaciones de T4T y T3T como ensayos únicos para evaluar la función tiroidea.

En lugar de esto la T4T y la T3T en suero se determinan como parte de un panel de dos determinaciones que incluyen una evaluación de la concentración de la principal proteína transportadora TBG, mediante un inmunoensayo de TBG o una prueba de “captación”. Específicamente, la relación matemática entre la concentración de hormona total y el resultado de la prueba de “captación”, se usa como “índice” de hormona libre (146). Los índices de hormonas libres (índice de T4L e índice de T3L) utilizados durante tres décadas, fueron rápidamente reemplazados por inmunoensayos que permiten estimar la hormona libre en un solo ensayo.

3. Intervalos de referencia normales para T4T y T3T séricas

Los valores de T4T presentan una cierta variabilidad entre los distintos métodos. Los rangos de referencia característicos se aproximan a 58-160 nmol/L (4,5-12,6 ?g/dL). De la misma manera los valores de T3T son dependientes del método empleado con rangos de referencia aproximados a 1,2 – 2,7 nmol/L (80 –180 ng/dL).

B. Métodos para estimar la concentración de Tiroxina Libre (T4L) y de Triyodotironina Libre (T3L)

Recomendación Nº 10. Determinaciones séricas de T4 total y de T3 total

Las concentraciones séricas anormales de T4T y T3T se encuentran más frecuentemente como resultado de anormalidades en las proteínas transportadoras que debido a una disfunción tiroidea.

*Los ensayos de T4 libre (T4L) se prefieren a los de T4T cuando la concentración de TBG es anormal. Sin embargo, los ensayos de T4L pueden carecer de exactitud diagnóstica cuando la afinidad de la TBG por las hormonas tiroideas está alterada o en presencia de proteínas ligantes de T4 anormales.

*Los ensayos de hormonas totales (T4T y T3T) deberían estar rápidamente  disponibles para tener la posibilidad de evaluar las causas de discordancia en los  ensayos de hormonas libres.

La T4 circulante está unida más fuertemente a las proteínas séricas que la T3, en consecuencia, la fracción biodisponible de T4 libre (T4L) es menor que la de T3 libre (0,02% versus 0,2%, T4L versus T3L, respectivamente). Lamentablemente, las técnicas físicas que se utilizan para separar las pequeñísimas fracciones de hormona libre de las fracciones predominantes unidas a proteínas son complejas, engorrosas, y relativamente costosas para el uso de rutina en el laboratorio clínico. Los métodos que emplean separación física entre la hormona libre y la unida (es decir,diálisis de equilibrio, ultrafiltración y filtración con gel) suelen estar disponibles sólo en los laboratorios de referencia. Los laboratorios clínicos de rutina comúnmente utilizan una variedad de ensayos para hormonas libres que estiman la concentración de hormona libre en presencia de hormona unida a proteínas.

Estas estimaciones de hormonas libres emplean la estrategia de realizar dos ensayos independientes para calcular el “índice” de hormona libre o diversos métodos de ensayos con ligandos (14,145,147). En realidad, a pesar de lo que sostienen los fabricantes, prácticamente la totalidad de los ensayos que estiman T4L y T3L dependen en cierto grado de las proteínas transportadoras (148,149). Esta dependencia impacta negativamente en la eficiencia diagnóstica de los métodos de hormonas libres, sujetos a diferentes interferencias que pueden causar resultados inapropiadamente anormales o una interpretación errónea de los mismos (Tabla 1).

Estas interferencias incluyen sensibilidad a proteínas transportadoras anormales, efectos in vivo o in vitro de diversos medicamentos, niveles elevados de ácidos grasos libres (FFA) e inhibidores endógenos o exógenos de la unión de la hormona a las proteínas transportadoras, presentes en ciertas condiciones patológicas (60).

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Recomendación Nº 11. Nomenclatura para los ensayos de hormonas libres

*Los métodos para hormonas libres utilizados por la mayoría de los laboratorios clínicos (índices e inmunoensayos) no emplean separación física entre la hormona  unida y la libre ni miden directamente las concentraciones de hormona libre. Estos  métodos se caracterizan por un cierto grado de dependencia de las proteínas transportadoras y sería más adecuado denominarlos ensayos de "Estimación de las hormonas libres", abreviándolos de la siguiente manera: ET4L y ET3L.

*En general, los ensayos de estimación de hormonas libres sobreestiman el nivel de T4L a altas concentraciones de proteínas y lo subestiman a bajas concentraciones.

 

1.Nomenclatura de los métodos que estiman T4 libre (T4L) y T3 libre (T3L)

La nomenclatura de los ensayos de hormonas libres es bastante confusa. Tampoco se ha logrado un acuerdo acerca de la validez técnica de estas mediciones ni de su utilidad clínica en condiciones asociadas con alteraciones en las proteínas transportadoras (145,147,148,150, 151). Las determinaciones de hormonas libres en los laboratorios clínicos se realizan utilizando índices que requieren dos ensayos separados, ensayos de ligandos en una única determinación, o métodos de separación física que separan la hormona libre de la unida a proteínas antes de su medida directa en la fracción libre. Los ensayos de ligandos están estandarizados con soluciones que contienen concentraciones de la hormona establecidas por gravimetría, o utilizan calibradores con valores asignados por un método de separación física (por ejemplo, diálisis de equilibrio y/o ultrafiltración).

Los métodos de separación física generalmente son manuales, técnicamente complejos y bastante costosos para el uso clínico de rutina. Los índices y los métodos de ligandos son los que se utilizan con más frecuencia en el laboratorio clínico, donde generalmente se realizan en autoanalizadores para inmunoensayos (17).

Lamentablemente, un exceso confuso de términos se ha utilizado para distinguir los diferentes métodos para hormonas libres, y la literatura está llena de inconsistencias en cuanto a la nomenclatura de estos métodos. En la actualidad, no hay una distinción metodológica clara entre términos como “T7”, “índice de tiroxina efectiva”, “de un paso”, “análogo”,“de dos pasos”, “retrotitulación”, “secuencial”,“inmunoextracción” o“inmunosecuestro”,“ensayo con ligandos” porque los fabricantes han modificado las técnicas originales o las han adaptado a la automatización(147). Después del lanzamiento de los métodos originales con “análogos” de un paso en la década del 70, el término “análogo” se volvió confuso (147).

La primera generación de ensayos con análogos de hormonas dependía en alto grado de las proteínas transportadoras y ha sido reemplazada por una nueva generación de ensayos de “análogos” con el anticuerpo marcado, que son más resistentes a la presencia de proteínas transportadoras anormales (147,152). Desafortunadamente, los fabricantes rara vez revelan todos los componentes de los ensayos o el número de pasos involucrados en un procedimiento automatizado, por lo que no es posible utilizar la nomenclatura del método (de dos pasos, análogo, etc.) para predecir su eficiencia diagnóstica al evaluar pacientes con anormalidades en las proteínas transportadoras (152).

2. Métodos para calcular los índices de hormona libre: índice de T4L y de T3L

Los índices permiten estimar la concentración de hormonas libres requiriendo dos determinaciones independientes (146). Una, es la determinación de hormona total (T4T o T3T), y la otra, es la evaluación de la concentración de la principal proteína transportadora de hormonas tiroideas, ya sea mediante un inmunoensayo de TBG, o mediante un ensayo de “captación” de T4 o de T3 denominado: Ensayo
de Proporción de hormona tiroidea unida (THBR). Otra posibilidad es calcular los índices combinando una determinación de T4T con una
estimación de la fracción de T4 libre establecida mediante diálisis isotópica. En este caso, la calidad y pureza del trazador utilizado repercuten fundamentalmente en la exactitud de los índices (149,153,154).

2.1. Índices que utilizan la determinación de TBG

El cálculo del índice de T4L utilizando la TBG sólo mejora la eficiencia diagnóstica en comparación con la T4T cuando la anormalidad de la T4T es el resultado de una concentración anormal de TBG. Además, el método del índice T4T/TBG no es completamente independiente de la TBG ni corrige las alteraciones en las proteínas transportadoras no relacionadas con la TBG, ni las originadas en las moléculas de TBG con afinidades anormales (141,155-158). Por lo tanto, a pesar de las ventajas teóricas de medir TBG, los índices T4T/TBG se utilizan muy poco porque la capacidad de unión de la TBG puede estar alterada independientemente de los cambios en su concentración, en especial en
pacientes con NTI (99). Además, la hormona unida a TBG refleja el 60 – 75% de la capacidad total de unión, por lo tanto, si se tiene en
cuenta sólo la unión a TBG, no se podrán detectar las anormalidades en la transtiretina y en la albúmina.

2.2. Índices que utilizan la Proporción de Hormona Tiroidea Unida (THBR) o Ensayos de “Captación”

Recomendación Nº 12. Ensayos de Proporción de hormona tiroidea unida (THBR) o Ensayos de "captación"

*Los ensayos de "captación" se deberían llamar ensayos de "Proporción de hormona tiroidea unida", abreviadas THBR, e incluir la hormona que se está utilizando, es  decir THBR (T4) o THBR (T3).

*Para las determinaciones de THBR se prefiere usar T4 como trazador (en lugar de  T3) para reflejar mejor las anormalidades de las proteínas transportadoras de T4.

*Los valores de THBR deberían informarse como una relación con el resultado de un suero normal que tiene un valor asignado de 1,00.

*Los cálculos de THBR deberían basarse en la relación entre las cuentas (cpm) del  adsorbente divididas por las cuentas totales menos las cuentas del absorbente, más que en la relación entre las cuentas del absorbente y las cuentas totales.

*Además del valor de la hormona total y del índice de hormona libre, debería  informarse el resultado de THBR.

*Los ensayos de THBR no deberían ser usados como parámetro independiente para evaluar el estado tiroideo, sino en relación con la determinación de T4T y/o de T3T, y para producir estimaciones de hormonas libres (índices de T4Lo T3L).

Los ensayos de “captación” se han usado para estimar la hormona tiroidea unida a proteínas como la validez de utilizar ensayos de captación
de T3 para corregir un valor de T4T es cuestionable, algunos ensayos no isotópicos actuales utilizan una “captación de T4”. Muchos fabricantes todavía utilizan el método “clásico” para producir ensayos de captación de T3 en los que el porcentaje de captación normal puede variar entre un 25% y un 49% (cuentas unidas/ cuentas totales). Tradicionalmente, el índice de tiroxina libre, a veces llamado “T7” deriva del producto de una prueba de captación de T3 y una determinación de TT4, frecuentemente expresada como un % de captación (cuentas unidas al adsorbente divididas por cuentas totales).

Los ensayos “clásicos” de captación de T3 o THBR típicamente están influenciados por la concentración endógena de T4 de la muestra. Esta limitación puede solucionarse utilizando un gran exceso de trazador de T4 no isotópicamente marcado con una afinidad por las proteínas transportadoras comparable a la de la T4. Los ensayos actuales de THBR generalmente producen valores normales en los índices de T4L y de T3L, cuando las anormalidades de la TBG son leves (por ejemplo, durante el embarazo). Sin embargo, algunos de estos ensayos pueden producir valores de índices inadecuadamente anormales cuando los pacientes tienen grandes alteraciones en las proteínas transportadoras (TBG congénitamente alta o baja, hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH), autoanticuerpos a hormonas tiroideas o NTI) y en presencia de algunos medicamentos que influyen en la unión de las hormonas tiroideas a sus proteínas.

2.3. Índices que utilizan una determinación de la fracción de hormonas libres

Los primeros ensayos de hormonas libres desarrollados en la década del 60 fueron índices calculados a partir del producto de la fracción de hormona libre de un dializado, multiplicado por la T4T (determinada por PBI y luego por RIA) (159,160). El método del índice de la fracción libre se extendió más tarde a la determinación de la velocidad de transferencia de la hormona marcada isotópicamente a través de una
membrana que separaba dos cámaras que contenían la misma muestra sin diluir. Los índices de hormonas libres calculados con
fracciones isotópicas libres no son completamente  independientes de la concentración de TBG y además están influenciados por la pureza radioquímica, la matriz del buffer y el factor de dilución utilizado (161,162).

Recomendación Nº 13. Para los fabricantes que desarrollan ensayos de estimación de hormonas libres

*Los métodos sin separación física entre la hormona unida y la libre no deben extraer más del 1-2% de la hormona unida a las proteínas transportadoras, para que se preserve el equilibrio dinámico tanto como sea posible.

*Minimizar los efectos de dilución que debilitan la influencia de los inhibidores  endógenos presentes en la muestra.

*Utilizar calibradores séricos que contengan concentraciones conocidas de hormona libre que se comporten en el ensayo de modo idéntico a las muestras de los  pacientes.

*Realizar los ensayos a 37ºC.

3.Ensayos con ligandos para la estimación de T4L y T3L

Estos métodos emplean el procedimiento de “un paso” o de “dos pasos”. Los ensayos de dos pasos utilizan una separación física de la hormona libre de la unida a proteína antes de medir la hormona libre con un inmunoensayo sensible, o, como alternativa, usan un anticuerpo para  inmuno-extraer una proporción de ligando de la muestra antes de la cuantificación. Por el contrario, los ensayos con ligandos de un paso intentan cuantificar la hormona libre en presencia de las proteínas transportadoras. Los métodos de dos pasos son menos susceptibles a artefactos no específicos. Los métodos en un solo paso pueden resultar inválidos cuando la muestra y los estándares difieren en su afinidad por el trazador del ensayo (60,145,150).

3.1. Ensayos con ligandos que utilizan separación física

Los métodos de T4L que separan físicamente la hormona libre de la unida a proteínas antes medir la concentración de hormona libre mediante un inmunoensayo sensible, se estandarizan utilizando soluciones que contengan T4 preparadas por gravimetría. La separación física de la hormona libre de la unida a proteína se logra con una membrana semipermeable que usa una cámara de diálisis, una técnica de ultrafiltración o una columna de adsorción con resina Sephadex LH-20 (161-165). Se necesita un RIA de T4 extremadamente sensible para medir las concentraciones de picomoles de T4L en dializados, o en la fracción libre separada, en comparación con determinaciones de hormona total en el rango nanomolar. Aunque no existe ningún método de determinación de hormona libre oficialmente reconocido como “patrón”, generalmente se considera que los métodos que emplean separación física son los menos influenciados por las proteínas transportadoras, y por inferencia, dan por resultado los valores de hormonas libres que mejor reflejan el nivel de hormonas libres circulantes (94,166). Sin embargo, los métodos de diálisis que emplean un paso de dilución pueden subestimar la T4L en presencia de inhibidores de la unión en la muestra, y la adsorción de la T4 a los materiales de la membrana puede significar un problema (94,166). Por el contrario, esos métodos pueden
sobreestimar la T4L sérica en pacientes heparinizados como resultado de la generación in vitro de ácidos grasos libres (FFA) (84,97,98,100,101,167-170).

Este efecto in vitro de la heparina es la causa primaria de valores falsamente altos de T4L en pacientes con NTI (101). Los métodos de separación física requieren demasiado esfuerzo y son muy costosos para su uso de rutina en los laboratorios clínicos y generalmente sólo están disponibles en laboratorios de referencia. Los métodos de T3L que emplean separación física sólo están disponibles en algunos laboratorios de investigación especializados (102).

3.2 Ensayos de ligandos sin separación física

La mayoría de los inmunoensayos para la determinación de hormonas libres actualmente en uso, emplean un anticuerpo específico con gran afinidad por la hormona para secuestrar una pequeña cantidad de la hormona total de la muestra. Los sitios de unión en el anticuerpo que se encuentran desocupados y que generalmente son inversamente proporcionales a la concentración de hormona libre se cuantifican utilizando hormona marcada con radioactividad, fluorescencia o quimioluminiscencia.
La señal luego se convierte en concentración de hormona libre utilizando calibradores con valores de hormona libre asignados por un método de separación física.
La proporción real de hormona tiroidea total secuestrada varía con el diseño del método, pero excede ampliamente la concentración real de hormona libre y debería ser 12% para minimizar la alteración del equilibrio hormona libre-unida. El secuestro activo de hormonas por los anticuerpos anti-hormonas tiroideas del ensayo, resulta en una continua separación de la hormona de las proteínas transportadoras y en una alteración del equilibrio entre unida y libre. La clave para la validez de estos métodos es doble. Primero, es necesario usar condiciones que mantengan el equilibrio entre la hormona libre y la unida a proteínas y minimizar los efectos de dilución que debilitan la influencia de los inhibidores endógenos presentes en la muestra. En segundo lugar, es importante utilizar calibradores séricos que contengan concentraciones conocidas de hormona libre, que se comporten en el ensayo de modo idéntico a las muestras de los pacientes. Se han utilizado tres métodos
generales para desarrollar inmunoensayos comparables para la determinación de T4L y T3L: (I) hormona marcada, de dos pasos; (II) análogo, marcado, de un paso; y (III) anticuerpo marcado.

3.2.a. Métodos de Hormona marcada, de dos pasos / Métodos de Retrotitulación

Los métodos de dos pasos se desarrollaron por primera vez con fines de investigación a fines de la década del 70 y luego se los adaptó para producir métodos comerciales de T4L y T3L. Durante el primer paso de incubación, estos métodos usaban un anticuerpo anti hormona de 11 alta afinidad (>1x10 L/mol) unido a un soporte sólido (Sephadex ultrafino, partículas o tubos recubiertos) para secuestrar una pequeña proporción de la hormona total de la muestra sérica.

Después de un breve período de incubación, los constituyentes del ensayo no unidos, se eliminaban por lavado antes del segundo paso en el que se agregaba suficiente hormona marcada para unirse a todos los sitios de ligadura desocupados del anticuerpo. Después del lavado, la cantidad de hormona marcada unida al anticuerpo en fase sólida se cuantifica con relación a estándares gravimétricos o a calibradores que tienen valores de hormona libre asignados por un método de referencia. Los métodos del análogo de la hormona marcado de un paso se
introdujeron también a fines de la década del 70. Estos nuevos ensayos eran menos laboriosos que las técnicas de dos pasos. Como resultado, los métodos en dos pasos perdieron popularidad a pesar de que los estudios comparativos mostraron que estaban menos afectados por la concentración de albúmina y las anormalidades en las proteínas transportadoras, las cuales ejercen un impacto negativo en la eficiencia diagnóstica de los ensayos de un solo paso (147,171-173).

3.2.b. Métodos de análogos marcados de la hormona de un paso

La validez fisicoquímica de los ensayos de análogos de hormonas marcados de un paso dependía del desarrollo de un análogo de la hormona con una estructura molecular que fuera totalmente no reactiva con las proteínas séricas pero que pudiese reaccionar con los sitios no ocupados del anticuerpo para la hormona. Cuando estas condiciones se cumplen,el análogo de la hormona, químicamente acoplado a una molécula de señal como un isótopo o una enzima, puede competir con la hormona libre por un número limitado de sitios de unión en el anticuerpo, en un formato clásico de inmunoensayo competitivo. Aunque conceptualmente atractivo, este método es técnicamente difícil de lograr en la práctica, a pesar de los supuestos éxitos iniciales. Los métodos de análogos de la hormona se crearon principalmente para proporcionar valores normales de T4L en estados de TBG elevada (por ejemplo, durante el embarazo). Sin embargo, se demostró que tenían una pobre exactitud
diagnóstica en presencia de concentraciones anormales de albúmina, FDH, NTI, niveles altos de FFA o autoanticuerpos anti hormonas tiroideas. Durante la década del 80 se realizaron esfuerzos considerables para corregir estos problemas mediante el agregado de productos químicos patentados para bloquear la unión del análogo a la albúmina o ajustando empíri-camente los valores del calibrador para corregir las desviaciones dependientes de las proteínas. No obstante, después de una década de críticas, la mayoría de los métodos del análogo de la hormona se han abandonado porque no fue posible resolver estos problemas (147).

3.2.c. Métodos de anticuerpo marcado

Los métodos de anticuerpo marcado también miden la hormona libre en función de la fracción de los sitios de unión del anticuerpo para la hormonaocupados. Estos métodos competitivos utilizan inmunoabsorbentes específicos en la mezcla de reacción para evaluar los sitios del anticuerpo no ocupados. Un método relacionado consiste en el uso de complejos hormona/proteína en fase sólida sin marcar (a veces también denominados “análogos”) que no reaccionan significativa-mente con las proteínas séricas, para cuanti-ficar los sitios no ocupados del anticuerpo en fase líquida. El fundamento fisicoquímico de estos métodos de anticuerpo marcado sugiere que pueden ser tan susceptibles a los mismos errores como los métodos más antiguos de análogos de hormona marcados.

Sin embargo, las diferencias fisicoquímicas que surgen de la fijación del análogo al soporte sólido generan diferencias cinéticas que dan por resultado una disminución en la afinidad de este análogo por las proteínas transportadoras y una determi-nación más confiable de la hormona libre. En la actualidad, el método de anticuerpo marcado es el preferido por la mayoría de los autoanalizadores.

3.3. Comportamiento de los ensayos de T4L y T3L en diferentes situaciones clínicas

La única razón para seleccionar ensayos de hormonas tiroideas libres (T4L o T3L) en vez de hormonas tiroideas totales (T4T o T3T) es lograr
una mejor eficiencia diagnóstica en la detección de hipo-e hipertiroidismo en pacientes con anormalidades en las proteínas de transporte que comprometan dicha eficiencia en las determinaciones de hormona total (60). Lamentablemente, la eficiencia diagnóstica de
los métodos actuales para la determinación de hormonas libres no se puede predecir en base a las características del método (de un solo paso,de dos pasos, de anticuerpo marcado, etc.) ni tampoco por su validación técnica por medio de procedimientos como la prueba de dilución de la muestra. Tanto los índices (FT4I y FT3I) como los métodos que involucran ligandos, son en cierto grado proteína-dependientes, y pueden
dar resultados no confiables cuando las proteínas transportadoras son significativamente anormales (148).

El fuerte impulso por desarrollar ensayos de hormonas libres, se ha debido a la alta frecuencia de anormalidades en las proteínas transportadoras que causan discordancia entre las hormonas totales y libres. Desafortunadamente, ningún método actual de T4L es válido en todas las situaciones clínicas. Cuando la concentración de TBG es anormal, la mayoría de los métodos de T4L dan resultados más útiles que la determinación de T4T. Sin embargo, en muchas situaciones asociadas con anormalidades de proteínas transportadoras aparecen artefactos pre-analíticos o analíticos: cuando la unión del trazador a la albúmina es anormal, en presencia de medicamentos que desplazan la T4 de la TBG, durante fases críticas de las enfermedades no tiroideas, y en el embarazo (ver Tabla 1). La frecuencia de estos artefactos en los ensayos de T4L sugiere que la TSH o la relación TSH / T4L es un parámetro tiroideo más confiable que la sola estimación de la T4L.

Un resultado discordante de T4L, se debería confirmar utilizando un método de otro fabricante (generalmente determinado en otro laboratorio). Adicional o alternativamente, se puede confirmar la discrepancia con la relación T4L / T4T ya que la interferencia rara vez afecta ambas determinaciones en el mismo grado y en la misma dirección.

3.3.a. Embarazo

El aumento de TBG sérica y las concentraciones de albúmina bajas asociados con el embarazo provocan amplias variaciones en las determinaciones de T4L, dependiendo del método (47,59). Los métodos que dependen de la albúmina pueden producir valores bajos de T4L hasta en un 50 por ciento de pacientes y no son adecuados para evaluar el estado tiroideo durante el embarazo, debido a la marcada desviación negativa atribuible a la progresiva disminución de la concentración de albúmina sérica en el tercer trimestre (59). Por el contrario, los métodos como la diálisis de equilibrio suelen mostrar una desviación positiva en relación con los métodos estándares, posiblemente debido a impurezas en el trazador (60). El uso de rangos de referencia específicos para el método y para cada trimestre podría mejorar la eficiencia diagnóstica de los ensayos de hormonas libres en el embarazo. Sin embargo, prácticamente ningún fabricante ha desarrollado dicha información para sus métodos.

Recomendación Nº 14. Utilidad clínica de los ensayos de estimación de T3 libre sérica

La medición de T3 sérica tiene escasa especificidad o sensibilidad para el diagnóstico de hipotiroidismo ya que el aumento en la conversión de la T4 a T3  mantiene normales las concentraciones de T3 hasta que el hipotiroidismo alcanza un grado severo. Los pacientes con NTI o deprivación calórica generalmente presentan valores bajos de T3 total y libre. Las determinaciones de T3 sérica, interpretadas  conjuntamente con la T4L, son útiles para el diagnóstico de presentaciones  complejas o inusuales de hipertiroidismo y de ciertas condiciones clínicas raras:

*Una elevada T3 sérica a menudo es un signo temprano de recurrencia de hipertiroidismo por Graves.

*La relación T3T/T4T se puede utilizar para investigar el hipertiroidismo por Graves versus el no-Graves. Concretamente, una elevada relación T3T/T4T> 20 (ng/?g) o >0,024 (nmol/nmol) sugiere el estímulo tiroideo característico de la enfermedad de Graves.

*La T3 sérica se puede utilizar para controlar la respuesta aguda al tratamiento de la tirotoxicosis de Graves.

*Una T3 sérica alta o paradójicamente normal puede indicar hipertiroidismo en un  paciente con enfermedad no tiroidea con TSH suprimida (< 0,01 mUI/L). *Una T3  sérica alta o paradójicamente normal puede indicar hipertiroidismo inducido por amiodarona.
*Los pacientes con bocio que viven en áreas de deficiencia de yoduro deberían controlar su T3L además de la TSH para detectar tirotoxicosis por T3 provocada por autonomía focal o multifocal.

*Una T3 sérica alta se encuentra frecuentemente en el bocio congénito debido a un  defecto en la organificación del yoduro (defecto de TPO), o a un defecto en la  síntesis de tiroglobulina.

*Una T3 sérica alta normalmente precede a la tirotoxicosis inducida por yodo cuando los pacientes tienen bocio multinodular de larga data.

*Una T3 sérica alta se ve frecuentemente en los tumores hipofisarios secretantes de  TSH.

*Una T3 sérica alta se ve frecuentemente en los síndromes de resistencia a las hormonas tiroideas que generalmente se presentan sin hipertiroidismo clínico.

*La determinación de T3 sérica es útil para controlar el cumplimento de la terapia supresiva con L-T3 previa al 131 centellograma con I en el carcinoma diferenciado de tiroides (CDT)

*La determinación de T3 sérica es útil para distinguir el hipertiroidismo leve  (subclínico)(con TSH baja y T4Lnormal) de la toxicosis por T3, a veces causada por suplementos dietéticos que contienen T3.

*La determinación de T3 sérica es útil para detectar deficiencia de yodo  (caracterizada por T4 baja y T3 alta).

*La determinación de T3 sérica puede ser útil durante el tratamiento con antitiroideos para detectar la persistencia del exceso de T3 a pesar del nivel normal o bajo de T4.

*La determinación de T3 sérica se puede usar para detectar recurrencia temprana de tirotoxicosis después de la suspensión del tratamiento con antitiroideos.

*La determinación de T3 sérica se puede usar para establecer el grado de exceso de T3 durante el tratamiento supresivo con L-T4 o después de una sobredosis  intencional de T4.

3.3.b. Infantes prematuros

Es frecuente encontrar un nivel bajo de tiroxina sin aumento de TSH en recién nacidos prematuros de menos de 28 semanas de gestación (39,176). Existe cierta evidencia clínica que sugiere que el tratamiento con L-T4 puede mejorar el resultado neurológico (176). No obstante, según se describió anteriormente, es probable que las diferencias metodológicas en los ensayos de T4L comprometan la confiabilidad de la detección de hipotiroxinemia en los prematuros.

3.3.c. Anormalidades genéticas en las proteínas transportadoras

Las variaciones hereditarias y adquiridas en la albúmina o en la TBG con afinidades alteradas para la T4 o la T3 pueden provocar concentraciones anormales de hormona total en sujetos eut i roideos que t ienen concentraciones normales de hormona libre (141). La variante de la albúmina responsable de la hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH) tiene una afinidad marcadamente aumentada por la T4, y por numerosos trazadores análogos de T4, lo que provoca estimaciones falsamente altas de T4L sérica con estos trazadores (145,177). En la FDH, los valores de la T4T y del Índice de T4L, al igual que algunos ensayos de T4L con ligandos, dan valores por encima de los normales, mientras que la T3T, T3L, TSH y T4L determinadas por otros métodos, incluida la diálisis de equilibrio,  dan valores normales (177).

La falla en reconocer la presencia de la variante anormal de albúmina en la FDH que puede tener una prevalencia hasta de 1:1000 en algunas
poblaciones de América Latina puede llevar a una interpretación errónea de los ensayos tiroideos que deriven en la ablación de la glándula. (178).

3.3.d. Autoanticuerpos

Los sueros de algunos pacientes contienen autoanticuerpos anti-hormonas tiroideas que originan artefactos metodológicos en las determinaciones de hormonas totales o libres (143, 145). Estas interferencias por anticuerpos son método-dependientes. La T4 o T3 marcadas ligadas al anticuerpo endógeno se interpretan erróneamente como fracción unida si se usan métodos de adsorción, o como fracción libre si se usan métodos de doble anticuerpo, lo cual lleva a falsos valores bajos o altos de T4T o T3T séricas, respectivamente. Los análogos de T4 usados como trazador en algunos ensayos de T4L pueden fijarse a estos autoanticuerpos y producir resultados falsamente altos de T4L.

Hay publicaciones que informan interferencia por anticuerpos anti-fase sólida, en los ensayos de anticuerpos marcados para hormonas libres (179).

3.3.e Tirotoxicosis e hipotiroidismo

La relación entre T4 total y libre y T3 en la tirotoxicosis no es lineal. En los casos de tirotoxicosis severa, los aumentos de T4T y T4L son desproporcionados. Esta falta de linealidad refleja una disminución de los niveles de TBG y una saturación de la capacidad ligante de la TBG a pesar del aumento de la unión a TTR y albúmina (180). Asimismo, las concentraciones de T3L se pueden subestimar como resultado de una unión T4-TBG elevada. En casos de hipotiroidismo severo se presenta la situación
opuesta, es decir, una reducción de ocupación de todas las proteínas transportadoras (180). En esta situación, el exceso de sitios de unión desocupados puede anular la respuesta de la T4L al tratamiento sustitutivo. Esto sugiere que una dosis inicial de descarga de L-T4 es el método más rápido para restaurar terapéuticamente el nivel normal de T4L en un paciente hipotiroideo.

3.3.f. Fármacos que compiten con las hormonas tiroideas por la unión a las proteínas transportadoras

Ciertos agentes terapéuticos y de diagnóstico como la Fenitoína, Carbamazepina o Furosemida pueden inhibir competitivamente la unión
de las hormonas tiroideas a las proteínas transportadoras. La reducción de la disponibilidad de la proteína transportadora origina un aumento agudo de T4L y en ciertos casos un incremento en la acción hormonal que se manifiesta por un descenso en la TSH (181). El aumento en las concentraciones de T4L está influido por la dilución utilizada en el método y ocurre también en los métodos por diálisis de equilibrio (182,183).

Durante la administración crónica de fármacos competidores de este tipo, hay un aumento en la depuración de la hormona. No obstante, con el tiempo el sistema restaura el equilibrio “normal” y se normalizan los niveles de T4L a expensas de una disminución en la concentración de T4T. La suspensión del fármaco en este momento causaría una caída inicial de T4L a medida que aumenta la disponibilidad de la proteína transportadora, con la renormalización de la T4L a medida que el equilibrio se re-establece mediante una liberación incrementada de la hormona desde la glándula tiroides. El tiempo que duran y la magnitud de los efectos de estos competidores difieren según su vida media.

Una serie de medicamentos y otros factores compiten con la T4 y la T3 por la unión a la TBG y provocan un aumento agudo en la
disponibilidad de T4L y T3L. Muchos de estos competidores son medicamentos prescriptos que tienen una afinidad diferente por la TBG que la T4 (96, 184).

La furosemida, por ejemplo, se une a la TBG pero con una afinidad aproximadamente tres veces menor que la T4, mientras que la aspirina se une con una afinidad siete veces menor que la T4 (170, 185). La competencia in vivo que se observa con estos agentes se relaciona con su afinidad por la TBG más que con sus niveles terapéuticos, la fracción libre o su afinidad por proteínas diferentes de la TBG, en especial la albúmina (170, 186).

Los ensayos actuales de T4L que emplean un factor de dilución pueden no detectar el aumento de T4L secundario a la presencia de competidores por la proteína transportadora. Por ejemplo, una muestra que contenga tanto T4 (fracción libre 1:4000) como un inhibidor competitivo (fracción libre 1:100) sometida a una dilución gradual, mantendrá una concentración de T4L hasta una dilución de 1:100 secundaria a la disociación progresiva de la T4 de las proteínas transportadoras. Por el contrario, la concentración del competidor libre disminuiría marcadamente sólo después de una dilución de 1:10. Por lo tanto, los ensayos para determinar T4L que empleen una dilución alta de la muestra subestimarán el efecto de desplazamiento de la hormona por los competidores. Este artefacto se puede minimizar mediante la utilización de diálisis de equilibrio simétrica y de ultrafiltración de suero sin diluir (94,165,187,188).

3.3.g Artefactos inducidos por el tratamiento con heparina

Se sabe que en presencia de concentraciones normales de albúmina, los ácidos grasos no esterificados (FFA) en concentraciones >3mmol/L aumentarán la T4L al desplazar la hormona de su unión a la TBG (84,97,98,100,101,167-170). El suero de los pacientes tratados con heparina, ncluida la de bajo peso molecular, puede presentar valores de T4 libre falsamente aumentados secundarios a la actividad in vitro de la lipasa inducida por la heparina, que provoca un aumento de los ácidos grasos libres. Este problema se presenta con dosis de heparina tan bajos como 10 unidades y se exacerba con la conservación de la muestra. Otros factores, como el aumento en los triglicéridos, las concentraciones bajas de albúmina, o una incubación prolongada del ensayo a 37ºC, pueden acentuar este problema.

3.3.h. Enfermedades no tiroideas graves

Hay un gran número de observaciones recolectadas durante más de dos décadas con respecto a la especificidad de diversos métodos
de determinación de T4L en pacientes hospitalizados con NTI. La literatura puede resultar confusa y complicada por la heterogeneidad de las poblaciones de pacientes estudiadas y la dependencia de los resultados con respecto a los métodos. Los fabricantes han modificado progresivamente sus métodos a lo largo del tiempo en un intento de mejorar la especificidad en esta y otras situaciones en las que se presentan anormalidades en las proteínas transportadoras.

Sin embargo, la composición exacta de los equipos de reactivos comerciales actuales sigue siendo confidencial y es difícil que los fabricantes obtengan muestras con antecedentes documentados de este tipo de pacientes para el análisis riguroso de sus métodos. En un trabajo comparativo reciente de métodos de T4L, se observó una diferencia marcada, dependiente del método, el séptimo día posterior al transplante de médula ósea en individuos eurotiroideos que recibían tratamiento con múltiples fármacos (incluidos heparina y glucocorticoides) (101).

En este estudio, las concentraciones de T4T fueron normales en la mayoría de los individuos (95%) y la TSH sérica fue < 0,1 mUI/L en aproximadamente en la mitad de los individuos, en relación directa con el tratamiento de glucocorticoides que recibían. Por el contrario, tanto valores altos como subnormales de T4L se informaron usando diferentes métodos. Es probable que las estimaciones supranormales de T4L obtenidas con algunos métodos en el 20 al 40% de los pacientes, reflejaran el efecto in vitro de la heparina intravenosa descripto anteriormente. Contrariamente, los métodos del análogo, sujetos a la influencia de la unión del trazador a la albúmina, produjeron estimaciones subnormales de T4L en el 20 al 30% de los pacientes (101). Estos artefactos en las determinaciones de T4L, originan discordancia entre los resultados de T4L y TSH, aumentan el riesgo de un diagnóstico erróneo de tirotoxicosis o de hipotiroidismo secundario, y sugieren que las determinaciones de T4T pueden ser más confiables en el marco de una enfermedad crítica.

Recomendación Nº 16. Para los fabricantes: Evaluación de la exactitud diagnóstica de los ensayos de estimación de T4L

*La eficiencia diagnóstica del método se debe analizar utilizando muestras de pacientes ambulatorios con antecedentes documentados de los siguientes problemas en las proteínas transportadoras:

  • anormalidades de la TBG (estrógenos elevados, exceso y deficiencia de TBG  congénita)
  • Hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH)
  • Aumento en la afinidad de la transtiretina (TTR)
  • Autoanticuerpos anti-T4 y anti-T3
  • Factor reumatoideo

*Evaluar la interferencia del método con muestras de suero normal a las que se le  agreguen concentraciones relevantes de inhibidores comunes, en concentraciones  que provoquen el desplazamiento de la hormona de las proteínas transportadoras en  suero sin diluir, efectos que se pierden después de la dilución:

  •  Furosemida 30 uM
  •  Ácido disalicílico 300 uM
  •  Fenitoína 75 uM
  •  Carbamazepina 8 uM

*Enumerar todas las interferencias conocidas con la magnitud y la dirección de los errores resultantes.

*Documentar los efectos in vitro de la heparina intravenosa sobre la generación de ácidos grasos no esterificados (NEFA), durante la incubación del ensayo.

3.4.Validación de los métodos de T4L

Desafortunadamente, la mayor parte de los métodos de estimación de hormonas libres reciben una evaluación inapropiada antes de que se los incorpore al uso clínico. Los fabricantes rara vez extienden la validación de sus métodos más allá del estudio de pacientes ambulatorios con hipo o hipertiroidismo, embarazadas y una categoría general denominada “pacientes hospitalizados /enfermedades no tiroideas”. Sin embargo, en la actualidad no se ha logrado un consenso acerca de los mejores criterios para la evaluación de estos métodos de estimación de T4 libre. Cabe mencionar que no es suficiente lograr la simple demostración de que un nuevo método pueda distinguir entre valores hipotiroideos, normales e hipertiroideos, ni que ofrezca la posibilidad de comparación con métodos vigentes ya que cualquier método de estimación de hormona libre satisfará estos criterios sin que necesariamente aporte información acerca de la verdadera concentración fisiológica de hormona libre.

Se deberían evaluar los nuevos métodos con muestras clínicas con antecedentes documentados, en especial con aquellas que pudieran representar un desafío para la validez del ensayo, o alternativamente, mediante la manipulación de los constituyentes de una muestra de suero normal para evaluar un criterio particular (148). Cualquiera sea el método que se adopte, los problemas clave se relacionan con la similitud entre las muestras y los estándares, porque todos los métodos son generalmente comparables. Otros procedimientos incluyen probar la recuperación de LT4 agregada, o los efectos de la dilución del suero, ya que una dilución al 100% de un suero “normal” teóricamente provocaría una reducción insignificante (menor al 2%) en la concentración de T4L (94,152) (58,189). Sin embargo, estos procedimientos, simplemente evalúan la “dependencia proteica” del método, es decir, el grado en que la T4 libre depende de la disociación de la hormona libre de la unida (148).

Podría predecirse que estos procedimientos evaluarán desfavorablemente los métodos que impliquen un elevado grado de dilución de la muestra comparados con aquellos que minimicen la dilución. Sin embargo, no hay evidencia que documente si estos procedimientos reflejan verdaderamente la eficiencia diagnóstica del método cuando se los usa para evaluar muestras clínicas complicadas. En última instancia, como en cualquier método diagnóstico, la especificidad de un método de T4 libre sólo será evidente después de evaluar un espectro completo de muestras de individuos con y sin disfunción tiroidea asociada con anormalidades en las proteínas transportadoras o con medicamentos que afecten la unión de las hormonas tiroideas a las proteínas plasmáticas.

La detección de una interferencia inesperada se puede lograr sólo después de que los métodos se hayan usado durante un cierto tiempo, como en el caso del factor reumatoideo que puede producir estimaciones de T4L falsamente altas (112). La fluorescencia no específica debido a sustancias en sangre como ácidos orgánicos en pacientes con uremia, puede ser otra causa de interferencia (190).

El procedimiento más adecuado es prestar particular atención a las muestras que probablemente causen interferencia no específica en el resultado (98). Idealmente, en pacientes ambulatorios se deberían incluir muestras que tengan: a) anormalidades de la TBG (embarazo, anticonceptivos orales, exceso y deficiencia congénitos de TGB); b) Hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH); c) autoanticuerpos anti-T4 y anti-T3; d) sustancias interferentes como el factor reumatoideo y e) el amplio espectro de drogas terapéuticas. En pacientes hospitalizados, se deberían evaluar tres categorías: a) pacientes sin disfunción tiroidea pero con T4T baja o alta debido a NTI b) pacientes con hipotiroidismo documentado asociado con NTI severas y c) pacientes con hipertiroidismo documentado asociado con NTI.
Sin embargo, la obtención de muestras con antecedentes documentados de este tipo de pacientes resulta excesivamente difícil para los
fabricantes. Como ningún fabricante ha probado su método en pacientes críticamente enfermos, es difícil para los médicos confiar en que un resultado de T4L anormal en esos pacientes refleje una disfunción tiroidea más que una NTI.

Por lo tanto, en pacientes hospitalizados con sospecha de disfunción tiroidea, una combinación de determinaciones de TSH y de T4T puede proveer más información que un único ensayo de T4L, siempre que el valor de T4T se interprete en relación con el grado de severidad de la enfermedad.

Concretamente, un valor bajo de T4T en las NTI normalmente se restringe a pacientes graves que están en unidades de cuidado intensivo. Un valor bajo de T4T en un paciente que no está críticamente enfermo debería sugerir que se considere una disfunción hipofisaria. En pacientes ambulatorios, las determinaciones de T4L suelen tener mayor exactitud diagnóstica que las de T4T. Sin embargo, cuando una T4L anormal no coincide con el cuadro clínico, o cuando haya una discordancia inexplicable en la relación TSH /T4 L, puede ser necesaria una T4 T confirmatoria. Alternativamente el laboratorio podría, enviar la muestra a otro laboratorio que use un método de T4L de otro fabricante, o a un laboratorio de referencia que pueda realizar T4L utilizando un método de separación física como la diálisis de equilibrio o la ultrafiltración.

3.5. Interferencias con los ensayos tiroideos

Idealmente, un ensayo de hormonas tiroideas debería carecer de la interferencia de cualquier compuesto, fármaco o sustancia endógena (por ejemplo bilirrubina) en cualquier muestra y a cualquier concentración. Los estudios disponibles de los fabricantes varían ampliamente en el número de compuestos estudiados y en las concentraciones evaluadas. Generalmente el laboratorio sólo puede detectar interferencia mediante la “comprobación de validez” de la relación entre la T4L y la TSH. Si se hace solamente un ensayo, generalmente el médico es el primero en sospechar una interferencia, cuando observa una inconsistencia entre el valor informado y el estado clínico del paciente.

Los procedimientos de control clásicos de laboratorio de comprobar la identidad de la muestra y realizar diluciones, no siempre detectan interferencias. Generalmente, las interferencias en las determinaciones de T4T o de T4L generan valores inadecuadamente anormales en presencia de TSH normal (Tabla 1). Las interferencias en los inmunoensayos competitivos y no-competitivos son de tres clases: (I) problemas de reactividad cruzada, (II) anticuerpos contra el analito endógeno e (III) interacciones farmacológicas (191).

(I) Reactividad cruzada

Los problemas de reactividad cruzada son el resultado de la incapacidad del anticuerpo para discriminar entre el analito y una molécula estructuralmente relacionada (192). Los ensayos de hormonas tiroideas son menos susceptibles a este tipo de interferencia que la TSH, porque los anticuerpos anti-yodotironinas se seleccionan para una mejor especificidad enfrentándolos con preparados purificados. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales, y de anticuerpos policlonales purificados por afinidad, redujo la reactividad cruzada de los ensayos actuales de T4 y T3 a menos de un 0,1 % para todos los precursores yodados y metabolitos de L-T4. No obstante, se han informado interferencias por el ácido 3-3',5- triyodotiroacético (TRIAC), en ensayos de T3L, y por D-T4 en ensayos de T4L (14,135).

(II) Autoanticuerpos endógenos

Autoanticuerpos endógenos anti-T4 y anti-T3 se han encontrado frecuentemente en el suero de pacientes con autoinmunidad tiroidea, y con enfermedades no tiroideas. A pesar de su alta prevalencia, la interferencia por este tipo de auto-anticuerpos es relativamente rara y se caracteriza por valores falsamente bajos o altos, según el diseño del ensayo utilizado (193).

(III) Interferencias por fármacos

Los métodos de separación física se utilizan para asignar valores a los calibradores empleados en la mayoría de los ensayos de estimación de T4L. Hay más similitud entre los intervalos de referencia de los diversos ensayos con ligandos que entre los métodos que emplean separación física. Los intervalos de referencia para los inmunoensayos de T4L son aproximadamente 9-23 pmol/L (0,7 –1,8 ng/dL). 

Por el contrario, el límite superior de T4L para los métodos que emplean separación física, como la diálisis de equilibrio, supera los 30 pmol/L (2,5 ng/dL). Los intervalos de referencia para los inmunoensayos de T3L se aproximan a 3,5-7,7 pmol/L (0,2 – 0,5 ng/dL).

En la actualidad, los métodos para determinar T3L que emplean separación física sólo están disponibles como ensayos de investigación
(102).

3.7. Estandarización o calibración

No existen estándares ni métodos internacionales para determinaciones de hormonas libres. (139). Aunque algunos métodos de referencia han sido sugeridos para T4T, resulta difícil adaptarlos para las hormonas libres. Cada método y cada fabricante enfocan el problema de la estandarización desde su perspectiva individual.

Los métodos de estimación de T4L que requieren dos ensayos independientes (diálisis de equilibrio con trazador y ultrafiltración, al igual que los métodos de índices) usan una determinación de hormona total y una determinación de la fracción libre. Los ensayos de hormonas totales se estandarizan con calibradores preparados gravimétricamente a partir de preparaciones hormonales altamente purificadas disponibles comercialmente. La fracción libre se determina registrando las cuentas radiactivas en el dializado o ultrafiltrado.

Alternativamente, en el caso de los métodos que utilizan índices, la saturación o la capacidad ligante de las proteínas transportadoras se determina utilizando ensayos de proporción de hormonas tiroideas unidas (THBR), a veces conocidos como pruebas de “captación”. Los ensayos THBR están estandarizados contra sueros con proteínas transportadoras normales a los que se les asigna un valor de 1,00.

La situación más complicada ocurre con los ensayos de estimación de hormonas libres con ligandos. En general, estos ensayos se comercializan con estándares que tienen valores conocidos o asignados de hormona libre determinados por un método de referencia (generalmente diálisis de equilibrio con RIA de la concentración de T4L del dializado). Los fabricantes generalmente realizan esto para establecer valores de hormonas libres para los calibradores con matriz de suero humano que contenga la hormona y la(s) proteína(s) transportadora(s) para incluirlos en el equipo.

Alternativamente, en el caso de hormonas fuertemente unidas, como la tiroxina, se puede usar la Ley de Acción de las Masas para calcular la concentración de hormona libre (194). La concentración de hormona total, que es una medida de la capacidad ligante total para la hormona en esa muestra sérica, y la constante de equilibrio proveen la información necesaria para calcular la concentración de hormona libre. Este procedimiento es válido para los calibradores y controles elaborados con suero humano que contiene una capacidad ligante de TBG normal. Esto le permite al fabricante producir calibradores y controles de concentraciones prefijadas.

Además, el uso de calibradores preparados según se ha descripto, permite compensar la extracción excesiva de la hormona de sus proteínas transportadoras. Concretamente, en el caso de la tiroxina y la triyodotironina, el anticuerpo del ensayo puede unirse a la hormona libre y al mismo tiempo extraer una cantidad significativa (~1-2%) de la hormona unida a proteínas. Si se realizara un ensayo directo, se produciría un aumento en la concentración de hormona libre debido a esa extracción excesiva. Sin embargo, el uso de calibradores de concentraciones conocidas de hormona libre preparados a partir de suero humano permite asociar valores específicos de señales que el sistema lee (isotópicas, enzimáticas, fluorescentes o quimioluminiscentes) a concentraciones conocidas de hormona libre.

No obstante, esto sólo será válido si el porcentaje de hormona extraída del calibrador es idéntico al extraído de la muestra del paciente. Esto no sucede con frecuencia en el caso de muestras que presentan anormalidades en las proteínas transportadoras (por ejemplo, TBG congénitamente alta o baja, FDH, NTI etc.).

4. Determinación de hormonas libres: el futuro

La era de los inmunoensayo para cuantificar hormonas tiroideas y esteroideas en fluidos biológicos se inició en la década del 70 y está alcanzando su etapa final. Emerge progresivamente la aplicación de espectrometría de masa avanzada para la cuantificación de hormonas en fluidos biológicos (138). No hay razones para dudar que la espectrometría de masa ofrecerá una mejor cuantificación ya que su especificidad analítica es mayor y su interferencia analítica menor que la de los inmunoensayos. Por el momento, este tipo de técnicas sólo se ha aplicado a las determinaciones de T4T (139).

No obstante, para los ensayos de hormona total, se mantendrá el requisito de la liberación completa de la hormona de los complejos proteína-hormona. Para los ensayos de hormona libre, también se mantendrá el requisito de una separación física de la hormona libre de la ligada a proteínas, antes de la cuantificación. Para lograrlo, se necesitará una nueva tecnología de separación antes de que se pueda considerar cualquier método como patrón.

La dilución implícita de pequeñas moléculas es una limitación de la diálisis de equilibrio que necesita ser resuelta. La ultrafiltración es una técnica con amplias posibilidades, pero los métodos actuales son demasiado poco robustos o demasiado imprácticos para tal fin. La calidad de las mediciones por espectrometría de masa de las hormonas que forman complejos con las proteínas séricas está en relación directa con los pasos de preparación de la muestra para la cuantificación. Sin embargo, el método de referencia ideal para hormonas libres sería una técnica que emplee ultrafiltración a 37ºC, para evitar los efectos de la dilución, y la medición directa de la hormona libre en el ultrafiltrado por espectrometría de masa.

Recomendación Nº 17. Para laboratorios que realizan ensayos de T4L y T3L

*Los médicos deberían estar informados acerca de los efectos de las drogas y de la exactitud diagnóstica de los ensayos utilizados para evaluar el estado tiroideo en los pacientes que presentan anormalidades de las proteínas transportadoras y  enfermedades severas.
*El laboratorio debería estar preparado para confirmar un resultado dudoso mediante una determinación de hormona total, o una nueva determinación de T4L realizada con un método de referencia que separe físicamente la hormona libre de la unida,  como la diálisis de equilibrio o la ultrafiltración.

*Se debería verificar cualquier interferencia en resultados cuestionables con una nueva determinación realizada con un método de otro fabricante. (En caso de ser  necesario, la muestra debería enviarse a otro laboratorio).

 

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A. Métodos para determinar Tiroxina Total (T4T) y Triyodotironina Total (T3T)

La tiroxina (T4) es la principal hormona secretada por la glándula tiroides. Toda la T4 circulante deriva de la secreción tiroidea. Por el contrario, sólo aproximadamente el 20% de la triyodotironina (T3) circulante es de origen tiroideo. La mayor parte de la T3 circulante se produce por acción enzimática en tejidos no tiroideos por la 5' monodeyodinación de la T4 (121). En efecto, la T4 aparece como una prohormona de la T3, biológicamente más activa.

La mayor parte de la T4 circulante (~99,98%) está ligada a proteínas plasmáticas de transporte específicas : la globulina transportadora detiroxina (TBG) (60-75%), la TTR/TBPA (transtiretina/prealbúmina) (15-30%) y la albúmina (~10%) (12,16).
Aproximadamente el 99,7% de la T3 circulante está unida a las proteínas plasmáticas, específicamente a la TBG, con una afinidad diez veces menor que la observada para la T4 (12).

Las hormonas tiroideas unidas a proteínas no ingresan a las células y, por lo tanto, se las considera biológicamente inertes, y funcionan como reservorios para la hormona tiroidea circulante.Por el contrario, las pequeñas fracciones de hormona libre penetran fácilmente en las células mediante mecanismos específicos de transporte a través de la membrana para ejercer sus efectos biológicos.

En la hipófisis, el mecanismo de retroalimentación negativo de las hormonas tiroideas sobre la secreción de TSH está mediado principalmente por la T3 producida in situ a partir de la T4 libre que entra en las células tirotróficas.

Técnicamente, ha sido más fácil desarrollar métodos para medir las concentraciones de hormonas tiroideas totales (libres + unidas a proteínas), que estimar las pequeñas concentraciones de hormonas libres.

Esto se debe a que las concentraciones de hormonas totales (T4T y T3T) se determinan a niveles nanomolares mientras que las concentraciones de hormonas libres (T4L y T3L) se miden en el rango de picomoles, y para ser válidas, esas mediciones deben estar libres de interferencia por las concentraciones mucho más altas de hormonas totales.

1.Métodos para la determinación de hormonas tiroideas totales

Los métodos para determinar T4T y T3T séricas han evolucionado a través de diversas tecnologías durante las últimas cuatro décadas.

Los ensayos de PBI, de la década del 50 que estimaban la concentración de T4T como “yodo unido a proteínas” fueron reemplazados en la década del 60, primero por métodos competitivos utilizando proteínas ligantes, y posteriormente en la década del 70 por métodos de radioinmunoensayo (RIA).

Actualmente, las concentraciones de T4T y T3T se miden por inmunoensayos competitivos que son principalmente no isotópicos y que usan enzimas , moléculas f luorescentes o quimioluminiscentes como señales (135). Los métodos para hormonas totales requieren la inclusión de un inhibidor (agente desplazante o bloqueante) como el ácido 8-anilino-1-naftaleno-sulfónico (ANS) o el salicilato para liberar la hormona de las proteínas transportadoras (136). El desplazamiento por parte de estos agentes de la unión de la hormona a las proteínas transportadoras, junto con la gran dilución de la muestra utilizada en los ensayos modernos, facilita la unión de la hormona al anticuerpo.

La determinación de T3T en una concentración diez veces menor en sangre, comparada con la de T4T, representa desafíos técnicos de sensibilidad y de precisión, a pesar del uso de mayores volúmenes de muestra (137). Si bien una determinación de T3 confiable en el rango alto es crítica para el diagnóstico de hipertiroidismo, también lo es una determinación confiable en el rango normal para ajustar la dosis de los fármacos antitiroideos, y detectar hipertiroidismo en pacientes enfermos hospitalizados, que pueden tener un valor paradójicamente normal de T3.

A pesar de la disponibilidad de preparaciones altamente purificadas de L-tiroxina y Ltriyodotironina cristalizadas (de la United States Pharmacopoeia (16201 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852) aún no se han establecido métodos de referencia para T4T ni T3T (138,139). La naturaleza higroscópica de las preparaciones cristalinas puede afectar la exactitud de la medición gravimétrica (140). En segundo lugar, los diluyentes utilizados para reconstituir las preparaciones de L-T4 y L-T3 que se usarán como calibradores son matrices proteicas modificadas o mezclas de sueros humanos a los que se les ha extraído la hormona. En cualquier caso, la composición proteica de la matriz de los calibradores no es idéntica a la del suero del paciente. Esto puede provocar que el inhibidor de la unión a proteínas (por ejemplo el ANS) libere diferentes cantidades de hormona de las proteínas del calibrador que de la TBG en la muestra del paciente. Esto puede afectar la exactitud diagnóstica del ensayo cuando las proteínas transportadoras son anormales, como en las NTI.

Recomendación Nº 9. Para los fabricantes que desarrollan métodos de T4T y de T3T

Las divergencias entre métodos deberían reducirse por:

*El desarrollo de preparaciones de referencia de L-T4 y LT3 y el establecimiento de métodos de referencia internacionales.

*Asegurar que los instrumentos de medición no sean sensibles a las diferencias  entre el suero humano y la matriz del calibrador.

*Asegurar que durante el proceso del ensayo, la cantidad de hormona tiroidea  liberada de las proteínas transportadoras séricas sea la misma que la liberada en  presencia del diluyente del calibrador.

2. Exactitud diagnóstica de las determinaciones de hormonas totales

La exactitud diagnóstica de las determinaciones de hormonas tiroideas totales sería igual a la de las hormonas libres si todos los pacientes tuvieran niveles idénticos de proteínas transportadoras (TBG, TTR/TBPA y albúmina) con afinidades similares para las hormonas
tiroideas. Lamentablemente, es más común que se presenten alteraciones en las concentraciones de T4T y T3T debido a alteraciones en las proteínas transportadoras, que debido a una verdadera disfunción tiroidea. En la práctica clínica resulta frecuente encontrar pacientes con alteraciones en la TBG secundarias a embarazo o tratamiento con estrógenos, como así también alteraciones genéticas (141). Las concentraciones y/o las afinidades anormales de la TBG por las hormonas tiroideas pueden distorsionar la relación entre las concentraciones de hormona total y libre (142).

Además, algunos sueros de pacientes contienen otras proteínas ligantes anormales, como los auto-anticuerpos anti-hormonas tiroideas, que
afectan la confiabi-lidad diagnóstica de las determinaciones de hormonas totales (143-145). Estas alteraciones en las proteínas transportadoras comprometen el uso de las determinaciones de T4T y T3T como ensayos únicos para evaluar la función tiroidea.

En lugar de esto la T4T y la T3T en suero se determinan como parte de un panel de dos determinaciones que incluyen una evaluación de la concentración de la principal proteína transportadora TBG, mediante un inmunoensayo de TBG o una prueba de “captación”. Específicamente, la relación matemática entre la concentración de hormona total y el resultado de la prueba de “captación”, se usa como “índice” de hormona libre (146). Los índices de hormonas libres (índice de T4L e índice de T3L) utilizados durante tres décadas, fueron rápidamente reemplazados por inmunoensayos que permiten estimar la hormona libre en un solo ensayo.

3. Intervalos de referencia normales para T4T y T3T séricas

Los valores de T4T presentan una cierta variabilidad entre los distintos métodos. Los rangos de referencia característicos se aproximan a 58-160 nmol/L (4,5-12,6 ?g/dL). De la misma manera los valores de T3T son dependientes del método empleado con rangos de referencia aproximados a 1,2 – 2,7 nmol/L (80 –180 ng/dL).

B. Métodos para estimar la concentración de Tiroxina Libre (T4L) y de Triyodotironina Libre (T3L)

Recomendación Nº 10. Determinaciones séricas de T4 total y de T3 total

Las concentraciones séricas anormales de T4T y T3T se encuentran más frecuentemente como resultado de anormalidades en las proteínas transportadoras que debido a una disfunción tiroidea.

*Los ensayos de T4 libre (T4L) se prefieren a los de T4T cuando la concentración de TBG es anormal. Sin embargo, los ensayos de T4L pueden carecer de exactitud diagnóstica cuando la afinidad de la TBG por las hormonas tiroideas está alterada o en presencia de proteínas ligantes de T4 anormales.

*Los ensayos de hormonas totales (T4T y T3T) deberían estar rápidamente  disponibles para tener la posibilidad de evaluar las causas de discordancia en los  ensayos de hormonas libres.

La T4 circulante está unida más fuertemente a las proteínas séricas que la T3, en consecuencia, la fracción biodisponible de T4 libre (T4L) es menor que la de T3 libre (0,02% versus 0,2%, T4L versus T3L, respectivamente). Lamentablemente, las técnicas físicas que se utilizan para separar las pequeñísimas fracciones de hormona libre de las fracciones predominantes unidas a proteínas son complejas, engorrosas, y relativamente costosas para el uso de rutina en el laboratorio clínico. Los métodos que emplean separación física entre la hormona libre y la unida (es decir,diálisis de equilibrio, ultrafiltración y filtración con gel) suelen estar disponibles sólo en los laboratorios de referencia. Los laboratorios clínicos de rutina comúnmente utilizan una variedad de ensayos para hormonas libres que estiman la concentración de hormona libre en presencia de hormona unida a proteínas.

Estas estimaciones de hormonas libres emplean la estrategia de realizar dos ensayos independientes para calcular el “índice” de hormona libre o diversos métodos de ensayos con ligandos (14,145,147). En realidad, a pesar de lo que sostienen los fabricantes, prácticamente la totalidad de los ensayos que estiman T4L y T3L dependen en cierto grado de las proteínas transportadoras (148,149). Esta dependencia impacta negativamente en la eficiencia diagnóstica de los métodos de hormonas libres, sujetos a diferentes interferencias que pueden causar resultados inapropiadamente anormales o una interpretación errónea de los mismos (Tabla 1).

Estas interferencias incluyen sensibilidad a proteínas transportadoras anormales, efectos in vivo o in vitro de diversos medicamentos, niveles elevados de ácidos grasos libres (FFA) e inhibidores endógenos o exógenos de la unión de la hormona a las proteínas transportadoras, presentes en ciertas condiciones patológicas (60).

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Recomendación Nº 11. Nomenclatura para los ensayos de hormonas libres

*Los métodos para hormonas libres utilizados por la mayoría de los laboratorios clínicos (índices e inmunoensayos) no emplean separación física entre la hormona  unida y la libre ni miden directamente las concentraciones de hormona libre. Estos  métodos se caracterizan por un cierto grado de dependencia de las proteínas transportadoras y sería más adecuado denominarlos ensayos de "Estimación de las hormonas libres", abreviándolos de la siguiente manera: ET4L y ET3L.

*En general, los ensayos de estimación de hormonas libres sobreestiman el nivel de T4L a altas concentraciones de proteínas y lo subestiman a bajas concentraciones.

 

1.Nomenclatura de los métodos que estiman T4 libre (T4L) y T3 libre (T3L)

La nomenclatura de los ensayos de hormonas libres es bastante confusa. Tampoco se ha logrado un acuerdo acerca de la validez técnica de estas mediciones ni de su utilidad clínica en condiciones asociadas con alteraciones en las proteínas transportadoras (145,147,148,150, 151). Las determinaciones de hormonas libres en los laboratorios clínicos se realizan utilizando índices que requieren dos ensayos separados, ensayos de ligandos en una única determinación, o métodos de separación física que separan la hormona libre de la unida a proteínas antes de su medida directa en la fracción libre. Los ensayos de ligandos están estandarizados con soluciones que contienen concentraciones de la hormona establecidas por gravimetría, o utilizan calibradores con valores asignados por un método de separación física (por ejemplo, diálisis de equilibrio y/o ultrafiltración).

Los métodos de separación física generalmente son manuales, técnicamente complejos y bastante costosos para el uso clínico de rutina. Los índices y los métodos de ligandos son los que se utilizan con más frecuencia en el laboratorio clínico, donde generalmente se realizan en autoanalizadores para inmunoensayos (17).

Lamentablemente, un exceso confuso de términos se ha utilizado para distinguir los diferentes métodos para hormonas libres, y la literatura está llena de inconsistencias en cuanto a la nomenclatura de estos métodos. En la actualidad, no hay una distinción metodológica clara entre términos como “T7”, “índice de tiroxina efectiva”, “de un paso”, “análogo”,“de dos pasos”, “retrotitulación”, “secuencial”,“inmunoextracción” o“inmunosecuestro”,“ensayo con ligandos” porque los fabricantes han modificado las técnicas originales o las han adaptado a la automatización(147). Después del lanzamiento de los métodos originales con “análogos” de un paso en la década del 70, el término “análogo” se volvió confuso (147).

La primera generación de ensayos con análogos de hormonas dependía en alto grado de las proteínas transportadoras y ha sido reemplazada por una nueva generación de ensayos de “análogos” con el anticuerpo marcado, que son más resistentes a la presencia de proteínas transportadoras anormales (147,152). Desafortunadamente, los fabricantes rara vez revelan todos los componentes de los ensayos o el número de pasos involucrados en un procedimiento automatizado, por lo que no es posible utilizar la nomenclatura del método (de dos pasos, análogo, etc.) para predecir su eficiencia diagnóstica al evaluar pacientes con anormalidades en las proteínas transportadoras (152).

2. Métodos para calcular los índices de hormona libre: índice de T4L y de T3L

Los índices permiten estimar la concentración de hormonas libres requiriendo dos determinaciones independientes (146). Una, es la determinación de hormona total (T4T o T3T), y la otra, es la evaluación de la concentración de la principal proteína transportadora de hormonas tiroideas, ya sea mediante un inmunoensayo de TBG, o mediante un ensayo de “captación” de T4 o de T3 denominado: Ensayo
de Proporción de hormona tiroidea unida (THBR). Otra posibilidad es calcular los índices combinando una determinación de T4T con una
estimación de la fracción de T4 libre establecida mediante diálisis isotópica. En este caso, la calidad y pureza del trazador utilizado repercuten fundamentalmente en la exactitud de los índices (149,153,154).

2.1. Índices que utilizan la determinación de TBG

El cálculo del índice de T4L utilizando la TBG sólo mejora la eficiencia diagnóstica en comparación con la T4T cuando la anormalidad de la T4T es el resultado de una concentración anormal de TBG. Además, el método del índice T4T/TBG no es completamente independiente de la TBG ni corrige las alteraciones en las proteínas transportadoras no relacionadas con la TBG, ni las originadas en las moléculas de TBG con afinidades anormales (141,155-158). Por lo tanto, a pesar de las ventajas teóricas de medir TBG, los índices T4T/TBG se utilizan muy poco porque la capacidad de unión de la TBG puede estar alterada independientemente de los cambios en su concentración, en especial en
pacientes con NTI (99). Además, la hormona unida a TBG refleja el 60 – 75% de la capacidad total de unión, por lo tanto, si se tiene en
cuenta sólo la unión a TBG, no se podrán detectar las anormalidades en la transtiretina y en la albúmina.

2.2. Índices que utilizan la Proporción de Hormona Tiroidea Unida (THBR) o Ensayos de “Captación”

Recomendación Nº 12. Ensayos de Proporción de hormona tiroidea unida (THBR) o Ensayos de "captación"

*Los ensayos de "captación" se deberían llamar ensayos de "Proporción de hormona tiroidea unida", abreviadas THBR, e incluir la hormona que se está utilizando, es  decir THBR (T4) o THBR (T3).

*Para las determinaciones de THBR se prefiere usar T4 como trazador (en lugar de  T3) para reflejar mejor las anormalidades de las proteínas transportadoras de T4.

*Los valores de THBR deberían informarse como una relación con el resultado de un suero normal que tiene un valor asignado de 1,00.

*Los cálculos de THBR deberían basarse en la relación entre las cuentas (cpm) del  adsorbente divididas por las cuentas totales menos las cuentas del absorbente, más que en la relación entre las cuentas del absorbente y las cuentas totales.

*Además del valor de la hormona total y del índice de hormona libre, debería  informarse el resultado de THBR.

*Los ensayos de THBR no deberían ser usados como parámetro independiente para evaluar el estado tiroideo, sino en relación con la determinación de T4T y/o de T3T, y para producir estimaciones de hormonas libres (índices de T4Lo T3L).

Los ensayos de “captación” se han usado para estimar la hormona tiroidea unida a proteínas como la validez de utilizar ensayos de captación
de T3 para corregir un valor de T4T es cuestionable, algunos ensayos no isotópicos actuales utilizan una “captación de T4”. Muchos fabricantes todavía utilizan el método “clásico” para producir ensayos de captación de T3 en los que el porcentaje de captación normal puede variar entre un 25% y un 49% (cuentas unidas/ cuentas totales). Tradicionalmente, el índice de tiroxina libre, a veces llamado “T7” deriva del producto de una prueba de captación de T3 y una determinación de TT4, frecuentemente expresada como un % de captación (cuentas unidas al adsorbente divididas por cuentas totales).

Los ensayos “clásicos” de captación de T3 o THBR típicamente están influenciados por la concentración endógena de T4 de la muestra. Esta limitación puede solucionarse utilizando un gran exceso de trazador de T4 no isotópicamente marcado con una afinidad por las proteínas transportadoras comparable a la de la T4. Los ensayos actuales de THBR generalmente producen valores normales en los índices de T4L y de T3L, cuando las anormalidades de la TBG son leves (por ejemplo, durante el embarazo). Sin embargo, algunos de estos ensayos pueden producir valores de índices inadecuadamente anormales cuando los pacientes tienen grandes alteraciones en las proteínas transportadoras (TBG congénitamente alta o baja, hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH), autoanticuerpos a hormonas tiroideas o NTI) y en presencia de algunos medicamentos que influyen en la unión de las hormonas tiroideas a sus proteínas.

2.3. Índices que utilizan una determinación de la fracción de hormonas libres

Los primeros ensayos de hormonas libres desarrollados en la década del 60 fueron índices calculados a partir del producto de la fracción de hormona libre de un dializado, multiplicado por la T4T (determinada por PBI y luego por RIA) (159,160). El método del índice de la fracción libre se extendió más tarde a la determinación de la velocidad de transferencia de la hormona marcada isotópicamente a través de una
membrana que separaba dos cámaras que contenían la misma muestra sin diluir. Los índices de hormonas libres calculados con
fracciones isotópicas libres no son completamente  independientes de la concentración de TBG y además están influenciados por la pureza radioquímica, la matriz del buffer y el factor de dilución utilizado (161,162).

Recomendación Nº 13. Para los fabricantes que desarrollan ensayos de estimación de hormonas libres

*Los métodos sin separación física entre la hormona unida y la libre no deben extraer más del 1-2% de la hormona unida a las proteínas transportadoras, para que se preserve el equilibrio dinámico tanto como sea posible.

*Minimizar los efectos de dilución que debilitan la influencia de los inhibidores  endógenos presentes en la muestra.

*Utilizar calibradores séricos que contengan concentraciones conocidas de hormona libre que se comporten en el ensayo de modo idéntico a las muestras de los  pacientes.

*Realizar los ensayos a 37ºC.

3.Ensayos con ligandos para la estimación de T4L y T3L

Estos métodos emplean el procedimiento de “un paso” o de “dos pasos”. Los ensayos de dos pasos utilizan una separación física de la hormona libre de la unida a proteína antes de medir la hormona libre con un inmunoensayo sensible, o, como alternativa, usan un anticuerpo para  inmuno-extraer una proporción de ligando de la muestra antes de la cuantificación. Por el contrario, los ensayos con ligandos de un paso intentan cuantificar la hormona libre en presencia de las proteínas transportadoras. Los métodos de dos pasos son menos susceptibles a artefactos no específicos. Los métodos en un solo paso pueden resultar inválidos cuando la muestra y los estándares difieren en su afinidad por el trazador del ensayo (60,145,150).

3.1. Ensayos con ligandos que utilizan separación física

Los métodos de T4L que separan físicamente la hormona libre de la unida a proteínas antes medir la concentración de hormona libre mediante un inmunoensayo sensible, se estandarizan utilizando soluciones que contengan T4 preparadas por gravimetría. La separación física de la hormona libre de la unida a proteína se logra con una membrana semipermeable que usa una cámara de diálisis, una técnica de ultrafiltración o una columna de adsorción con resina Sephadex LH-20 (161-165). Se necesita un RIA de T4 extremadamente sensible para medir las concentraciones de picomoles de T4L en dializados, o en la fracción libre separada, en comparación con determinaciones de hormona total en el rango nanomolar. Aunque no existe ningún método de determinación de hormona libre oficialmente reconocido como “patrón”, generalmente se considera que los métodos que emplean separación física son los menos influenciados por las proteínas transportadoras, y por inferencia, dan por resultado los valores de hormonas libres que mejor reflejan el nivel de hormonas libres circulantes (94,166). Sin embargo, los métodos de diálisis que emplean un paso de dilución pueden subestimar la T4L en presencia de inhibidores de la unión en la muestra, y la adsorción de la T4 a los materiales de la membrana puede significar un problema (94,166). Por el contrario, esos métodos pueden
sobreestimar la T4L sérica en pacientes heparinizados como resultado de la generación in vitro de ácidos grasos libres (FFA) (84,97,98,100,101,167-170).

Este efecto in vitro de la heparina es la causa primaria de valores falsamente altos de T4L en pacientes con NTI (101). Los métodos de separación física requieren demasiado esfuerzo y son muy costosos para su uso de rutina en los laboratorios clínicos y generalmente sólo están disponibles en laboratorios de referencia. Los métodos de T3L que emplean separación física sólo están disponibles en algunos laboratorios de investigación especializados (102).

3.2 Ensayos de ligandos sin separación física

La mayoría de los inmunoensayos para la determinación de hormonas libres actualmente en uso, emplean un anticuerpo específico con gran afinidad por la hormona para secuestrar una pequeña cantidad de la hormona total de la muestra. Los sitios de unión en el anticuerpo que se encuentran desocupados y que generalmente son inversamente proporcionales a la concentración de hormona libre se cuantifican utilizando hormona marcada con radioactividad, fluorescencia o quimioluminiscencia.
La señal luego se convierte en concentración de hormona libre utilizando calibradores con valores de hormona libre asignados por un método de separación física.
La proporción real de hormona tiroidea total secuestrada varía con el diseño del método, pero excede ampliamente la concentración real de hormona libre y debería ser 12% para minimizar la alteración del equilibrio hormona libre-unida. El secuestro activo de hormonas por los anticuerpos anti-hormonas tiroideas del ensayo, resulta en una continua separación de la hormona de las proteínas transportadoras y en una alteración del equilibrio entre unida y libre. La clave para la validez de estos métodos es doble. Primero, es necesario usar condiciones que mantengan el equilibrio entre la hormona libre y la unida a proteínas y minimizar los efectos de dilución que debilitan la influencia de los inhibidores endógenos presentes en la muestra. En segundo lugar, es importante utilizar calibradores séricos que contengan concentraciones conocidas de hormona libre, que se comporten en el ensayo de modo idéntico a las muestras de los pacientes. Se han utilizado tres métodos
generales para desarrollar inmunoensayos comparables para la determinación de T4L y T3L: (I) hormona marcada, de dos pasos; (II) análogo, marcado, de un paso; y (III) anticuerpo marcado.

3.2.a. Métodos de Hormona marcada, de dos pasos / Métodos de Retrotitulación

Los métodos de dos pasos se desarrollaron por primera vez con fines de investigación a fines de la década del 70 y luego se los adaptó para producir métodos comerciales de T4L y T3L. Durante el primer paso de incubación, estos métodos usaban un anticuerpo anti hormona de 11 alta afinidad (>1x10 L/mol) unido a un soporte sólido (Sephadex ultrafino, partículas o tubos recubiertos) para secuestrar una pequeña proporción de la hormona total de la muestra sérica.

Después de un breve período de incubación, los constituyentes del ensayo no unidos, se eliminaban por lavado antes del segundo paso en el que se agregaba suficiente hormona marcada para unirse a todos los sitios de ligadura desocupados del anticuerpo. Después del lavado, la cantidad de hormona marcada unida al anticuerpo en fase sólida se cuantifica con relación a estándares gravimétricos o a calibradores que tienen valores de hormona libre asignados por un método de referencia. Los métodos del análogo de la hormona marcado de un paso se
introdujeron también a fines de la década del 70. Estos nuevos ensayos eran menos laboriosos que las técnicas de dos pasos. Como resultado, los métodos en dos pasos perdieron popularidad a pesar de que los estudios comparativos mostraron que estaban menos afectados por la concentración de albúmina y las anormalidades en las proteínas transportadoras, las cuales ejercen un impacto negativo en la eficiencia diagnóstica de los ensayos de un solo paso (147,171-173).

3.2.b. Métodos de análogos marcados de la hormona de un paso

La validez fisicoquímica de los ensayos de análogos de hormonas marcados de un paso dependía del desarrollo de un análogo de la hormona con una estructura molecular que fuera totalmente no reactiva con las proteínas séricas pero que pudiese reaccionar con los sitios no ocupados del anticuerpo para la hormona. Cuando estas condiciones se cumplen,el análogo de la hormona, químicamente acoplado a una molécula de señal como un isótopo o una enzima, puede competir con la hormona libre por un número limitado de sitios de unión en el anticuerpo, en un formato clásico de inmunoensayo competitivo. Aunque conceptualmente atractivo, este método es técnicamente difícil de lograr en la práctica, a pesar de los supuestos éxitos iniciales. Los métodos de análogos de la hormona se crearon principalmente para proporcionar valores normales de T4L en estados de TBG elevada (por ejemplo, durante el embarazo). Sin embargo, se demostró que tenían una pobre exactitud
diagnóstica en presencia de concentraciones anormales de albúmina, FDH, NTI, niveles altos de FFA o autoanticuerpos anti hormonas tiroideas. Durante la década del 80 se realizaron esfuerzos considerables para corregir estos problemas mediante el agregado de productos químicos patentados para bloquear la unión del análogo a la albúmina o ajustando empíri-camente los valores del calibrador para corregir las desviaciones dependientes de las proteínas. No obstante, después de una década de críticas, la mayoría de los métodos del análogo de la hormona se han abandonado porque no fue posible resolver estos problemas (147).

3.2.c. Métodos de anticuerpo marcado

Los métodos de anticuerpo marcado también miden la hormona libre en función de la fracción de los sitios de unión del anticuerpo para la hormonaocupados. Estos métodos competitivos utilizan inmunoabsorbentes específicos en la mezcla de reacción para evaluar los sitios del anticuerpo no ocupados. Un método relacionado consiste en el uso de complejos hormona/proteína en fase sólida sin marcar (a veces también denominados “análogos”) que no reaccionan significativa-mente con las proteínas séricas, para cuanti-ficar los sitios no ocupados del anticuerpo en fase líquida. El fundamento fisicoquímico de estos métodos de anticuerpo marcado sugiere que pueden ser tan susceptibles a los mismos errores como los métodos más antiguos de análogos de hormona marcados.

Sin embargo, las diferencias fisicoquímicas que surgen de la fijación del análogo al soporte sólido generan diferencias cinéticas que dan por resultado una disminución en la afinidad de este análogo por las proteínas transportadoras y una determi-nación más confiable de la hormona libre. En la actualidad, el método de anticuerpo marcado es el preferido por la mayoría de los autoanalizadores.

3.3. Comportamiento de los ensayos de T4L y T3L en diferentes situaciones clínicas

La única razón para seleccionar ensayos de hormonas tiroideas libres (T4L o T3L) en vez de hormonas tiroideas totales (T4T o T3T) es lograr
una mejor eficiencia diagnóstica en la detección de hipo-e hipertiroidismo en pacientes con anormalidades en las proteínas de transporte que comprometan dicha eficiencia en las determinaciones de hormona total (60). Lamentablemente, la eficiencia diagnóstica de
los métodos actuales para la determinación de hormonas libres no se puede predecir en base a las características del método (de un solo paso,de dos pasos, de anticuerpo marcado, etc.) ni tampoco por su validación técnica por medio de procedimientos como la prueba de dilución de la muestra. Tanto los índices (FT4I y FT3I) como los métodos que involucran ligandos, son en cierto grado proteína-dependientes, y pueden
dar resultados no confiables cuando las proteínas transportadoras son significativamente anormales (148).

El fuerte impulso por desarrollar ensayos de hormonas libres, se ha debido a la alta frecuencia de anormalidades en las proteínas transportadoras que causan discordancia entre las hormonas totales y libres. Desafortunadamente, ningún método actual de T4L es válido en todas las situaciones clínicas. Cuando la concentración de TBG es anormal, la mayoría de los métodos de T4L dan resultados más útiles que la determinación de T4T. Sin embargo, en muchas situaciones asociadas con anormalidades de proteínas transportadoras aparecen artefactos pre-analíticos o analíticos: cuando la unión del trazador a la albúmina es anormal, en presencia de medicamentos que desplazan la T4 de la TBG, durante fases críticas de las enfermedades no tiroideas, y en el embarazo (ver Tabla 1). La frecuencia de estos artefactos en los ensayos de T4L sugiere que la TSH o la relación TSH / T4L es un parámetro tiroideo más confiable que la sola estimación de la T4L.

Un resultado discordante de T4L, se debería confirmar utilizando un método de otro fabricante (generalmente determinado en otro laboratorio). Adicional o alternativamente, se puede confirmar la discrepancia con la relación T4L / T4T ya que la interferencia rara vez afecta ambas determinaciones en el mismo grado y en la misma dirección.

3.3.a. Embarazo

El aumento de TBG sérica y las concentraciones de albúmina bajas asociados con el embarazo provocan amplias variaciones en las determinaciones de T4L, dependiendo del método (47,59). Los métodos que dependen de la albúmina pueden producir valores bajos de T4L hasta en un 50 por ciento de pacientes y no son adecuados para evaluar el estado tiroideo durante el embarazo, debido a la marcada desviación negativa atribuible a la progresiva disminución de la concentración de albúmina sérica en el tercer trimestre (59). Por el contrario, los métodos como la diálisis de equilibrio suelen mostrar una desviación positiva en relación con los métodos estándares, posiblemente debido a impurezas en el trazador (60). El uso de rangos de referencia específicos para el método y para cada trimestre podría mejorar la eficiencia diagnóstica de los ensayos de hormonas libres en el embarazo. Sin embargo, prácticamente ningún fabricante ha desarrollado dicha información para sus métodos.

Recomendación Nº 14. Utilidad clínica de los ensayos de estimación de T3 libre sérica

La medición de T3 sérica tiene escasa especificidad o sensibilidad para el diagnóstico de hipotiroidismo ya que el aumento en la conversión de la T4 a T3  mantiene normales las concentraciones de T3 hasta que el hipotiroidismo alcanza un grado severo. Los pacientes con NTI o deprivación calórica generalmente presentan valores bajos de T3 total y libre. Las determinaciones de T3 sérica, interpretadas  conjuntamente con la T4L, son útiles para el diagnóstico de presentaciones  complejas o inusuales de hipertiroidismo y de ciertas condiciones clínicas raras:

*Una elevada T3 sérica a menudo es un signo temprano de recurrencia de hipertiroidismo por Graves.

*La relación T3T/T4T se puede utilizar para investigar el hipertiroidismo por Graves versus el no-Graves. Concretamente, una elevada relación T3T/T4T> 20 (ng/?g) o >0,024 (nmol/nmol) sugiere el estímulo tiroideo característico de la enfermedad de Graves.

*La T3 sérica se puede utilizar para controlar la respuesta aguda al tratamiento de la tirotoxicosis de Graves.

*Una T3 sérica alta o paradójicamente normal puede indicar hipertiroidismo en un  paciente con enfermedad no tiroidea con TSH suprimida (< 0,01 mUI/L). *Una T3  sérica alta o paradójicamente normal puede indicar hipertiroidismo inducido por amiodarona.
*Los pacientes con bocio que viven en áreas de deficiencia de yoduro deberían controlar su T3L además de la TSH para detectar tirotoxicosis por T3 provocada por autonomía focal o multifocal.

*Una T3 sérica alta se encuentra frecuentemente en el bocio congénito debido a un  defecto en la organificación del yoduro (defecto de TPO), o a un defecto en la  síntesis de tiroglobulina.

*Una T3 sérica alta normalmente precede a la tirotoxicosis inducida por yodo cuando los pacientes tienen bocio multinodular de larga data.

*Una T3 sérica alta se ve frecuentemente en los tumores hipofisarios secretantes de  TSH.

*Una T3 sérica alta se ve frecuentemente en los síndromes de resistencia a las hormonas tiroideas que generalmente se presentan sin hipertiroidismo clínico.

*La determinación de T3 sérica es útil para controlar el cumplimento de la terapia supresiva con L-T3 previa al 131 centellograma con I en el carcinoma diferenciado de tiroides (CDT)

*La determinación de T3 sérica es útil para distinguir el hipertiroidismo leve  (subclínico)(con TSH baja y T4Lnormal) de la toxicosis por T3, a veces causada por suplementos dietéticos que contienen T3.

*La determinación de T3 sérica es útil para detectar deficiencia de yodo  (caracterizada por T4 baja y T3 alta).

*La determinación de T3 sérica puede ser útil durante el tratamiento con antitiroideos para detectar la persistencia del exceso de T3 a pesar del nivel normal o bajo de T4.

*La determinación de T3 sérica se puede usar para detectar recurrencia temprana de tirotoxicosis después de la suspensión del tratamiento con antitiroideos.

*La determinación de T3 sérica se puede usar para establecer el grado de exceso de T3 durante el tratamiento supresivo con L-T4 o después de una sobredosis  intencional de T4.

3.3.b. Infantes prematuros

Es frecuente encontrar un nivel bajo de tiroxina sin aumento de TSH en recién nacidos prematuros de menos de 28 semanas de gestación (39,176). Existe cierta evidencia clínica que sugiere que el tratamiento con L-T4 puede mejorar el resultado neurológico (176). No obstante, según se describió anteriormente, es probable que las diferencias metodológicas en los ensayos de T4L comprometan la confiabilidad de la detección de hipotiroxinemia en los prematuros.

3.3.c. Anormalidades genéticas en las proteínas transportadoras

Las variaciones hereditarias y adquiridas en la albúmina o en la TBG con afinidades alteradas para la T4 o la T3 pueden provocar concentraciones anormales de hormona total en sujetos eut i roideos que t ienen concentraciones normales de hormona libre (141). La variante de la albúmina responsable de la hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH) tiene una afinidad marcadamente aumentada por la T4, y por numerosos trazadores análogos de T4, lo que provoca estimaciones falsamente altas de T4L sérica con estos trazadores (145,177). En la FDH, los valores de la T4T y del Índice de T4L, al igual que algunos ensayos de T4L con ligandos, dan valores por encima de los normales, mientras que la T3T, T3L, TSH y T4L determinadas por otros métodos, incluida la diálisis de equilibrio,  dan valores normales (177).

La falla en reconocer la presencia de la variante anormal de albúmina en la FDH que puede tener una prevalencia hasta de 1:1000 en algunas
poblaciones de América Latina puede llevar a una interpretación errónea de los ensayos tiroideos que deriven en la ablación de la glándula. (178).

3.3.d. Autoanticuerpos

Los sueros de algunos pacientes contienen autoanticuerpos anti-hormonas tiroideas que originan artefactos metodológicos en las determinaciones de hormonas totales o libres (143, 145). Estas interferencias por anticuerpos son método-dependientes. La T4 o T3 marcadas ligadas al anticuerpo endógeno se interpretan erróneamente como fracción unida si se usan métodos de adsorción, o como fracción libre si se usan métodos de doble anticuerpo, lo cual lleva a falsos valores bajos o altos de T4T o T3T séricas, respectivamente. Los análogos de T4 usados como trazador en algunos ensayos de T4L pueden fijarse a estos autoanticuerpos y producir resultados falsamente altos de T4L.

Hay publicaciones que informan interferencia por anticuerpos anti-fase sólida, en los ensayos de anticuerpos marcados para hormonas libres (179).

3.3.e Tirotoxicosis e hipotiroidismo

La relación entre T4 total y libre y T3 en la tirotoxicosis no es lineal. En los casos de tirotoxicosis severa, los aumentos de T4T y T4L son desproporcionados. Esta falta de linealidad refleja una disminución de los niveles de TBG y una saturación de la capacidad ligante de la TBG a pesar del aumento de la unión a TTR y albúmina (180). Asimismo, las concentraciones de T3L se pueden subestimar como resultado de una unión T4-TBG elevada. En casos de hipotiroidismo severo se presenta la situación
opuesta, es decir, una reducción de ocupación de todas las proteínas transportadoras (180). En esta situación, el exceso de sitios de unión desocupados puede anular la respuesta de la T4L al tratamiento sustitutivo. Esto sugiere que una dosis inicial de descarga de L-T4 es el método más rápido para restaurar terapéuticamente el nivel normal de T4L en un paciente hipotiroideo.

3.3.f. Fármacos que compiten con las hormonas tiroideas por la unión a las proteínas transportadoras

Ciertos agentes terapéuticos y de diagnóstico como la Fenitoína, Carbamazepina o Furosemida pueden inhibir competitivamente la unión
de las hormonas tiroideas a las proteínas transportadoras. La reducción de la disponibilidad de la proteína transportadora origina un aumento agudo de T4L y en ciertos casos un incremento en la acción hormonal que se manifiesta por un descenso en la TSH (181). El aumento en las concentraciones de T4L está influido por la dilución utilizada en el método y ocurre también en los métodos por diálisis de equilibrio (182,183).

Durante la administración crónica de fármacos competidores de este tipo, hay un aumento en la depuración de la hormona. No obstante, con el tiempo el sistema restaura el equilibrio “normal” y se normalizan los niveles de T4L a expensas de una disminución en la concentración de T4T. La suspensión del fármaco en este momento causaría una caída inicial de T4L a medida que aumenta la disponibilidad de la proteína transportadora, con la renormalización de la T4L a medida que el equilibrio se re-establece mediante una liberación incrementada de la hormona desde la glándula tiroides. El tiempo que duran y la magnitud de los efectos de estos competidores difieren según su vida media.

Una serie de medicamentos y otros factores compiten con la T4 y la T3 por la unión a la TBG y provocan un aumento agudo en la
disponibilidad de T4L y T3L. Muchos de estos competidores son medicamentos prescriptos que tienen una afinidad diferente por la TBG que la T4 (96, 184).

La furosemida, por ejemplo, se une a la TBG pero con una afinidad aproximadamente tres veces menor que la T4, mientras que la aspirina se une con una afinidad siete veces menor que la T4 (170, 185). La competencia in vivo que se observa con estos agentes se relaciona con su afinidad por la TBG más que con sus niveles terapéuticos, la fracción libre o su afinidad por proteínas diferentes de la TBG, en especial la albúmina (170, 186).

Los ensayos actuales de T4L que emplean un factor de dilución pueden no detectar el aumento de T4L secundario a la presencia de competidores por la proteína transportadora. Por ejemplo, una muestra que contenga tanto T4 (fracción libre 1:4000) como un inhibidor competitivo (fracción libre 1:100) sometida a una dilución gradual, mantendrá una concentración de T4L hasta una dilución de 1:100 secundaria a la disociación progresiva de la T4 de las proteínas transportadoras. Por el contrario, la concentración del competidor libre disminuiría marcadamente sólo después de una dilución de 1:10. Por lo tanto, los ensayos para determinar T4L que empleen una dilución alta de la muestra subestimarán el efecto de desplazamiento de la hormona por los competidores. Este artefacto se puede minimizar mediante la utilización de diálisis de equilibrio simétrica y de ultrafiltración de suero sin diluir (94,165,187,188).

3.3.g Artefactos inducidos por el tratamiento con heparina

Se sabe que en presencia de concentraciones normales de albúmina, los ácidos grasos no esterificados (FFA) en concentraciones >3mmol/L aumentarán la T4L al desplazar la hormona de su unión a la TBG (84,97,98,100,101,167-170). El suero de los pacientes tratados con heparina, ncluida la de bajo peso molecular, puede presentar valores de T4 libre falsamente aumentados secundarios a la actividad in vitro de la lipasa inducida por la heparina, que provoca un aumento de los ácidos grasos libres. Este problema se presenta con dosis de heparina tan bajos como 10 unidades y se exacerba con la conservación de la muestra. Otros factores, como el aumento en los triglicéridos, las concentraciones bajas de albúmina, o una incubación prolongada del ensayo a 37ºC, pueden acentuar este problema.

3.3.h. Enfermedades no tiroideas graves

Hay un gran número de observaciones recolectadas durante más de dos décadas con respecto a la especificidad de diversos métodos
de determinación de T4L en pacientes hospitalizados con NTI. La literatura puede resultar confusa y complicada por la heterogeneidad de las poblaciones de pacientes estudiadas y la dependencia de los resultados con respecto a los métodos. Los fabricantes han modificado progresivamente sus métodos a lo largo del tiempo en un intento de mejorar la especificidad en esta y otras situaciones en las que se presentan anormalidades en las proteínas transportadoras.

Sin embargo, la composición exacta de los equipos de reactivos comerciales actuales sigue siendo confidencial y es difícil que los fabricantes obtengan muestras con antecedentes documentados de este tipo de pacientes para el análisis riguroso de sus métodos. En un trabajo comparativo reciente de métodos de T4L, se observó una diferencia marcada, dependiente del método, el séptimo día posterior al transplante de médula ósea en individuos eurotiroideos que recibían tratamiento con múltiples fármacos (incluidos heparina y glucocorticoides) (101).

En este estudio, las concentraciones de T4T fueron normales en la mayoría de los individuos (95%) y la TSH sérica fue < 0,1 mUI/L en aproximadamente en la mitad de los individuos, en relación directa con el tratamiento de glucocorticoides que recibían. Por el contrario, tanto valores altos como subnormales de T4L se informaron usando diferentes métodos. Es probable que las estimaciones supranormales de T4L obtenidas con algunos métodos en el 20 al 40% de los pacientes, reflejaran el efecto in vitro de la heparina intravenosa descripto anteriormente. Contrariamente, los métodos del análogo, sujetos a la influencia de la unión del trazador a la albúmina, produjeron estimaciones subnormales de T4L en el 20 al 30% de los pacientes (101). Estos artefactos en las determinaciones de T4L, originan discordancia entre los resultados de T4L y TSH, aumentan el riesgo de un diagnóstico erróneo de tirotoxicosis o de hipotiroidismo secundario, y sugieren que las determinaciones de T4T pueden ser más confiables en el marco de una enfermedad crítica.

Recomendación Nº 16. Para los fabricantes: Evaluación de la exactitud diagnóstica de los ensayos de estimación de T4L

*La eficiencia diagnóstica del método se debe analizar utilizando muestras de pacientes ambulatorios con antecedentes documentados de los siguientes problemas en las proteínas transportadoras:

  • anormalidades de la TBG (estrógenos elevados, exceso y deficiencia de TBG  congénita)
  • Hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH)
  • Aumento en la afinidad de la transtiretina (TTR)
  • Autoanticuerpos anti-T4 y anti-T3
  • Factor reumatoideo

*Evaluar la interferencia del método con muestras de suero normal a las que se le  agreguen concentraciones relevantes de inhibidores comunes, en concentraciones  que provoquen el desplazamiento de la hormona de las proteínas transportadoras en  suero sin diluir, efectos que se pierden después de la dilución:

  •  Furosemida 30 uM
  •  Ácido disalicílico 300 uM
  •  Fenitoína 75 uM
  •  Carbamazepina 8 uM

*Enumerar todas las interferencias conocidas con la magnitud y la dirección de los errores resultantes.

*Documentar los efectos in vitro de la heparina intravenosa sobre la generación de ácidos grasos no esterificados (NEFA), durante la incubación del ensayo.

3.4.Validación de los métodos de T4L

Desafortunadamente, la mayor parte de los métodos de estimación de hormonas libres reciben una evaluación inapropiada antes de que se los incorpore al uso clínico. Los fabricantes rara vez extienden la validación de sus métodos más allá del estudio de pacientes ambulatorios con hipo o hipertiroidismo, embarazadas y una categoría general denominada “pacientes hospitalizados /enfermedades no tiroideas”. Sin embargo, en la actualidad no se ha logrado un consenso acerca de los mejores criterios para la evaluación de estos métodos de estimación de T4 libre. Cabe mencionar que no es suficiente lograr la simple demostración de que un nuevo método pueda distinguir entre valores hipotiroideos, normales e hipertiroideos, ni que ofrezca la posibilidad de comparación con métodos vigentes ya que cualquier método de estimación de hormona libre satisfará estos criterios sin que necesariamente aporte información acerca de la verdadera concentración fisiológica de hormona libre.

Se deberían evaluar los nuevos métodos con muestras clínicas con antecedentes documentados, en especial con aquellas que pudieran representar un desafío para la validez del ensayo, o alternativamente, mediante la manipulación de los constituyentes de una muestra de suero normal para evaluar un criterio particular (148). Cualquiera sea el método que se adopte, los problemas clave se relacionan con la similitud entre las muestras y los estándares, porque todos los métodos son generalmente comparables. Otros procedimientos incluyen probar la recuperación de LT4 agregada, o los efectos de la dilución del suero, ya que una dilución al 100% de un suero “normal” teóricamente provocaría una reducción insignificante (menor al 2%) en la concentración de T4L (94,152) (58,189). Sin embargo, estos procedimientos, simplemente evalúan la “dependencia proteica” del método, es decir, el grado en que la T4 libre depende de la disociación de la hormona libre de la unida (148).

Podría predecirse que estos procedimientos evaluarán desfavorablemente los métodos que impliquen un elevado grado de dilución de la muestra comparados con aquellos que minimicen la dilución. Sin embargo, no hay evidencia que documente si estos procedimientos reflejan verdaderamente la eficiencia diagnóstica del método cuando se los usa para evaluar muestras clínicas complicadas. En última instancia, como en cualquier método diagnóstico, la especificidad de un método de T4 libre sólo será evidente después de evaluar un espectro completo de muestras de individuos con y sin disfunción tiroidea asociada con anormalidades en las proteínas transportadoras o con medicamentos que afecten la unión de las hormonas tiroideas a las proteínas plasmáticas.

La detección de una interferencia inesperada se puede lograr sólo después de que los métodos se hayan usado durante un cierto tiempo, como en el caso del factor reumatoideo que puede producir estimaciones de T4L falsamente altas (112). La fluorescencia no específica debido a sustancias en sangre como ácidos orgánicos en pacientes con uremia, puede ser otra causa de interferencia (190).

El procedimiento más adecuado es prestar particular atención a las muestras que probablemente causen interferencia no específica en el resultado (98). Idealmente, en pacientes ambulatorios se deberían incluir muestras que tengan: a) anormalidades de la TBG (embarazo, anticonceptivos orales, exceso y deficiencia congénitos de TGB); b) Hipertiroxinemia disalbuminémica familiar (FDH); c) autoanticuerpos anti-T4 y anti-T3; d) sustancias interferentes como el factor reumatoideo y e) el amplio espectro de drogas terapéuticas. En pacientes hospitalizados, se deberían evaluar tres categorías: a) pacientes sin disfunción tiroidea pero con T4T baja o alta debido a NTI b) pacientes con hipotiroidismo documentado asociado con NTI severas y c) pacientes con hipertiroidismo documentado asociado con NTI.
Sin embargo, la obtención de muestras con antecedentes documentados de este tipo de pacientes resulta excesivamente difícil para los
fabricantes. Como ningún fabricante ha probado su método en pacientes críticamente enfermos, es difícil para los médicos confiar en que un resultado de T4L anormal en esos pacientes refleje una disfunción tiroidea más que una NTI.

Por lo tanto, en pacientes hospitalizados con sospecha de disfunción tiroidea, una combinación de determinaciones de TSH y de T4T puede proveer más información que un único ensayo de T4L, siempre que el valor de T4T se interprete en relación con el grado de severidad de la enfermedad.

Concretamente, un valor bajo de T4T en las NTI normalmente se restringe a pacientes graves que están en unidades de cuidado intensivo. Un valor bajo de T4T en un paciente que no está críticamente enfermo debería sugerir que se considere una disfunción hipofisaria. En pacientes ambulatorios, las determinaciones de T4L suelen tener mayor exactitud diagnóstica que las de T4T. Sin embargo, cuando una T4L anormal no coincide con el cuadro clínico, o cuando haya una discordancia inexplicable en la relación TSH /T4 L, puede ser necesaria una T4 T confirmatoria. Alternativamente el laboratorio podría, enviar la muestra a otro laboratorio que use un método de T4L de otro fabricante, o a un laboratorio de referencia que pueda realizar T4L utilizando un método de separación física como la diálisis de equilibrio o la ultrafiltración.

3.5. Interferencias con los ensayos tiroideos

Idealmente, un ensayo de hormonas tiroideas debería carecer de la interferencia de cualquier compuesto, fármaco o sustancia endógena (por ejemplo bilirrubina) en cualquier muestra y a cualquier concentración. Los estudios disponibles de los fabricantes varían ampliamente en el número de compuestos estudiados y en las concentraciones evaluadas. Generalmente el laboratorio sólo puede detectar interferencia mediante la “comprobación de validez” de la relación entre la T4L y la TSH. Si se hace solamente un ensayo, generalmente el médico es el primero en sospechar una interferencia, cuando observa una inconsistencia entre el valor informado y el estado clínico del paciente.

Los procedimientos de control clásicos de laboratorio de comprobar la identidad de la muestra y realizar diluciones, no siempre detectan interferencias. Generalmente, las interferencias en las determinaciones de T4T o de T4L generan valores inadecuadamente anormales en presencia de TSH normal (Tabla 1). Las interferencias en los inmunoensayos competitivos y no-competitivos son de tres clases: (I) problemas de reactividad cruzada, (II) anticuerpos contra el analito endógeno e (III) interacciones farmacológicas (191).

(I) Reactividad cruzada

Los problemas de reactividad cruzada son el resultado de la incapacidad del anticuerpo para discriminar entre el analito y una molécula estructuralmente relacionada (192). Los ensayos de hormonas tiroideas son menos susceptibles a este tipo de interferencia que la TSH, porque los anticuerpos anti-yodotironinas se seleccionan para una mejor especificidad enfrentándolos con preparados purificados. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales, y de anticuerpos policlonales purificados por afinidad, redujo la reactividad cruzada de los ensayos actuales de T4 y T3 a menos de un 0,1 % para todos los precursores yodados y metabolitos de L-T4. No obstante, se han informado interferencias por el ácido 3-3',5- triyodotiroacético (TRIAC), en ensayos de T3L, y por D-T4 en ensayos de T4L (14,135).

(II) Autoanticuerpos endógenos

Autoanticuerpos endógenos anti-T4 y anti-T3 se han encontrado frecuentemente en el suero de pacientes con autoinmunidad tiroidea, y con enfermedades no tiroideas. A pesar de su alta prevalencia, la interferencia por este tipo de auto-anticuerpos es relativamente rara y se caracteriza por valores falsamente bajos o altos, según el diseño del ensayo utilizado (193).

(III) Interferencias por fármacos

Los métodos de separación física se utilizan para asignar valores a los calibradores empleados en la mayoría de los ensayos de estimación de T4L. Hay más similitud entre los intervalos de referencia de los diversos ensayos con ligandos que entre los métodos que emplean separación física. Los intervalos de referencia para los inmunoensayos de T4L son aproximadamente 9-23 pmol/L (0,7 –1,8 ng/dL). 

Por el contrario, el límite superior de T4L para los métodos que emplean separación física, como la diálisis de equilibrio, supera los 30 pmol/L (2,5 ng/dL). Los intervalos de referencia para los inmunoensayos de T3L se aproximan a 3,5-7,7 pmol/L (0,2 – 0,5 ng/dL).

En la actualidad, los métodos para determinar T3L que emplean separación física sólo están disponibles como ensayos de investigación
(102).

3.7. Estandarización o calibración

No existen estándares ni métodos internacionales para determinaciones de hormonas libres. (139). Aunque algunos métodos de referencia han sido sugeridos para T4T, resulta difícil adaptarlos para las hormonas libres. Cada método y cada fabricante enfocan el problema de la estandarización desde su perspectiva individual.

Los métodos de estimación de T4L que requieren dos ensayos independientes (diálisis de equilibrio con trazador y ultrafiltración, al igual que los métodos de índices) usan una determinación de hormona total y una determinación de la fracción libre. Los ensayos de hormonas totales se estandarizan con calibradores preparados gravimétricamente a partir de preparaciones hormonales altamente purificadas disponibles comercialmente. La fracción libre se determina registrando las cuentas radiactivas en el dializado o ultrafiltrado.

Alternativamente, en el caso de los métodos que utilizan índices, la saturación o la capacidad ligante de las proteínas transportadoras se determina utilizando ensayos de proporción de hormonas tiroideas unidas (THBR), a veces conocidos como pruebas de “captación”. Los ensayos THBR están estandarizados contra sueros con proteínas transportadoras normales a los que se les asigna un valor de 1,00.

La situación más complicada ocurre con los ensayos de estimación de hormonas libres con ligandos. En general, estos ensayos se comercializan con estándares que tienen valores conocidos o asignados de hormona libre determinados por un método de referencia (generalmente diálisis de equilibrio con RIA de la concentración de T4L del dializado). Los fabricantes generalmente realizan esto para establecer valores de hormonas libres para los calibradores con matriz de suero humano que contenga la hormona y la(s) proteína(s) transportadora(s) para incluirlos en el equipo.

Alternativamente, en el caso de hormonas fuertemente unidas, como la tiroxina, se puede usar la Ley de Acción de las Masas para calcular la concentración de hormona libre (194). La concentración de hormona total, que es una medida de la capacidad ligante total para la hormona en esa muestra sérica, y la constante de equilibrio proveen la información necesaria para calcular la concentración de hormona libre. Este procedimiento es válido para los calibradores y controles elaborados con suero humano que contiene una capacidad ligante de TBG normal. Esto le permite al fabricante producir calibradores y controles de concentraciones prefijadas.

Además, el uso de calibradores preparados según se ha descripto, permite compensar la extracción excesiva de la hormona de sus proteínas transportadoras. Concretamente, en el caso de la tiroxina y la triyodotironina, el anticuerpo del ensayo puede unirse a la hormona libre y al mismo tiempo extraer una cantidad significativa (~1-2%) de la hormona unida a proteínas. Si se realizara un ensayo directo, se produciría un aumento en la concentración de hormona libre debido a esa extracción excesiva. Sin embargo, el uso de calibradores de concentraciones conocidas de hormona libre preparados a partir de suero humano permite asociar valores específicos de señales que el sistema lee (isotópicas, enzimáticas, fluorescentes o quimioluminiscentes) a concentraciones conocidas de hormona libre.

No obstante, esto sólo será válido si el porcentaje de hormona extraída del calibrador es idéntico al extraído de la muestra del paciente. Esto no sucede con frecuencia en el caso de muestras que presentan anormalidades en las proteínas transportadoras (por ejemplo, TBG congénitamente alta o baja, FDH, NTI etc.).

4. Determinación de hormonas libres: el futuro

La era de los inmunoensayo para cuantificar hormonas tiroideas y esteroideas en fluidos biológicos se inició en la década del 70 y está alcanzando su etapa final. Emerge progresivamente la aplicación de espectrometría de masa avanzada para la cuantificación de hormonas en fluidos biológicos (138). No hay razones para dudar que la espectrometría de masa ofrecerá una mejor cuantificación ya que su especificidad analítica es mayor y su interferencia analítica menor que la de los inmunoensayos. Por el momento, este tipo de técnicas sólo se ha aplicado a las determinaciones de T4T (139).

No obstante, para los ensayos de hormona total, se mantendrá el requisito de la liberación completa de la hormona de los complejos proteína-hormona. Para los ensayos de hormona libre, también se mantendrá el requisito de una separación física de la hormona libre de la ligada a proteínas, antes de la cuantificación. Para lograrlo, se necesitará una nueva tecnología de separación antes de que se pueda considerar cualquier método como patrón.

La dilución implícita de pequeñas moléculas es una limitación de la diálisis de equilibrio que necesita ser resuelta. La ultrafiltración es una técnica con amplias posibilidades, pero los métodos actuales son demasiado poco robustos o demasiado imprácticos para tal fin. La calidad de las mediciones por espectrometría de masa de las hormonas que forman complejos con las proteínas séricas está en relación directa con los pasos de preparación de la muestra para la cuantificación. Sin embargo, el método de referencia ideal para hormonas libres sería una técnica que emplee ultrafiltración a 37ºC, para evitar los efectos de la dilución, y la medición directa de la hormona libre en el ultrafiltrado por espectrometría de masa.

Recomendación Nº 17. Para laboratorios que realizan ensayos de T4L y T3L

*Los médicos deberían estar informados acerca de los efectos de las drogas y de la exactitud diagnóstica de los ensayos utilizados para evaluar el estado tiroideo en los pacientes que presentan anormalidades de las proteínas transportadoras y  enfermedades severas.
*El laboratorio debería estar preparado para confirmar un resultado dudoso mediante una determinación de hormona total, o una nueva determinación de T4L realizada con un método de referencia que separe físicamente la hormona libre de la unida,  como la diálisis de equilibrio o la ultrafiltración.

*Se debería verificar cualquier interferencia en resultados cuestionables con una nueva determinación realizada con un método de otro fabricante. (En caso de ser  necesario, la muestra debería enviarse a otro laboratorio).

 

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