Revista Bioreview Edición 48 - Agosto 2015

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Un test diagnóstico - Resguardar la Salud Reproductiva de la Mujer

 

 

 

 

Bioq. Mónica A. Rodríguez  

Tecnología de PCR en tiempo real (qPCR) - Detección de Chlamydia trachomatis

 

Introducción

Chlamydia trachomatis es el agente de mayor prevalencia entre las Infecciones bacterianas de Transmisión Sexual (ITS), siendo las mujeres quienes transportan la mayor carga de la enfermedad. Estas mujeres son la fuente potencial de infección para sus parejas  sexuales.

C. trachomatis causa uretritis en el varón y cervicitis mucopurulenta, uretritis y endometritis en la mujer.

Las infecciones por C. trachomatis son asintomáticas en el 90% de las mujeres y en más del 50% de los varones. De esto surge la importancia de los programas de screening para intensificar el testeo.

La Organización Mundial de la Salud (OMS), en su último informe sobre la incidencia y prevalencia global de las infecciones curables de transmisión sexual del año 2008, muestra un total de nuevos casos por año en adultos entre 15 y 49 años de 105,5 millones de  casos de C. trachomatis.

La infección por C. trachomatis puede causar infertilidad en hombres y mujeres. El 10-15% de las mujeres con infecciones no tratadas desarrollarán Enfermedad Inflamatoria Pelviana (E.I.P.) u otra severa secuela como infertilidad o embarazo extrauterino.

La E.I.P. es usualmente el resultado de la infección ascendente desde el endocérvix causando endometritis, salpingitis, parametritis, abscesos tubáricos y peritonitis.

La infección ascendente durante el embarazo puede ocasionar ruptura de membranas, corioamnionitis, infección puerperal e infección neonatal (conjuntivitis y neumonía).

También se ha visto que estas infecciones conllevan un aumento de riesgo en el desarrollo de cáncer cérvico uterino.

Por otro lado varios estudios confirman que la infección por C. trachomatis del tracto genital facilita la transmisión de HIV. La posible interrelación entre  HIV y C. trachomatis incluye la patogénesis intracelular invasiva de C. trachomatis, causando daño sustancial del epitelio lo que facilita la infección HIV y a su vez los cambios debidos a la infección por HIV pueden favorecer la infección por C. trachomatis.

Las guías del CDC para la prevención y control de las ITS recomienda que toda mujer sexualmente activa menor a 25 años de edad y las mujeres mayores a 25 años con factores de riesgo deben ser rutinariamente tamizadas en búsqueda de C. trachomatis una vez al  año. También se recomienda el screening para las mujeres embarazadas para prevenir las infecciones verticales al neonato.

El Control de las ITS es una prioridad de Salud Pública

El diagnóstico temprano, tratamiento y notificación a las respectivas parejas son cruciales  para reducir la incidencia de nuevos casos de infección genital por Chlamydia trachomatis como así también la prevalencia de la infección.

Suecia tiene una larga historia de screening oportunístico para clamidia y mandatoria notificación a las parejas. Tanto los laboratorios como los médicos reportan a los centros de control de enfermedad nacional y regional respecto al número de casos diagnosticados y  casos clínicos individuales.

En un estado del sudoeste de Suecia se observó una disminución del 25% de las infecciones por C. trachomatis. Posteriormente se reveló una deleción en el plásmido críptico.

Una nueva variante de Chlamydia trachomatis (nvCT) fue  descubierta en Suecia cuando se secuenció el plásmido críptico, encontrándose una deleción de 377 pares de bases (pb) en el área target de los tests de detección empleados.

El Instituto Sueco para el Control de Enfermedades Infecciosas recomendó que en los estados que usaban estos tests, con un solo blanco de acción en el plásmido críptico, las muestras con sospecha de infección por clamidia fueran enviadas a un laboratorio de referencia para la detección de la cepa mutante. Se reportó 39% de la nueva variante y posteriormente la nueva variante fue encontrada en Dinamarca.

La historia de nvCT ha puesto de relieve la importancia de la vigilancia epidemiológica para la evidencia de cambios biológicos insospechados que tienen impacto sobre el diagnóstico de salud pública.

Para minimizar el riesgo de resultados falsos negativos los sistemas de detección deben contar con diferentes targets en la misma reacción del test.

El nuevo Gold Standard

Las técnicas de última generación, tecnologías de PCR en tiempo real (qPCR) con dos blancos omp1 y plásmido críptico.

artus®C. trachomatis PlusRG PCR kit se encuentra aprobado para la detección de C.trachomatis en muestras oculares, cervicales, uretrales, semen y muestras de orina.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El artus®C. trachomatis PlusRG PCR kit tiene dos dianas de detección para Chlamydia trachomatis una de 111 pb del plásmido críptico y otra de 106 pb del genoma en el gen ompA que codifica para la proteína de membrana externa MOMP.

La detección específica de ambos amplificados se ve en el canal de fluorescencia Green (FAM) del Rotor Gene Q (RGQ). Además este kit contiene un segundo sistema de amplificación heterólogo para detectar posible inhibición de PCR. Este Control Interno (CI) se detecta en el canal de fluorescencia Yellow (JOE) del Rotor gene Q ( RGQ) de Qiagen. Se incluye un Control Positivo externo.

El diagnóstico de C. trachomatis mediante qPCR se basa en la amplificación de estas regiones específicas previamente enunciadas. La detección del producto amplificado es mediante los fluorocromos acoplados a sondas de oligonucleótidos que van ligándose  específicamente a la secuencia que se amplifica.

En cuanto a la sensibilidad analítica es de 0,04 be/?l (p = 0,05). Esto significa que hay un 95% de posibilidades de que se detecten 0,04 be/?l.

Mientras que la sensibilidad analítica incluyendo el método de purificación mediante columnas QIAamp DNA Mini kit, Qiagen 300 be/mL (p = 0,05). Esto significa que hay un 95% de posibilidades de que se detecten 300 be/mL.

En cuanto a la especificidad, se controló la comparación de secuencias y se analizó la especificidad del kit frente a serovares relevantes de cepas ATCC de C. trachomatis.

También se analizó la especificidad del kit frente a posibles reacciones cruzadas con diferentes patógenos y ninguno de los agentes  patógenos sometidos a la prueba resultó reactivo.

C. trachomatis es uno de los patógenos de transmisión sexual más predominante a nivel mundial. No existen limitaciones técnicas para su diagnóstico, por lo que es posible estimar la verdadera prevalencia en nuestro medio, tener un diagnóstico oportuno y evitar las serias complicaciones de salud de una enfermedad silente.

Referencias Bibliográficas

Unemo M, Olcén P, Agné-Stadling I, Feldt I, Jurstrand M, Herrmann B, et al. Experiences with the new genetic variant of Chlamydia trachomatis in Örebro county, Sweden – proportion, characteristics and effective diagnostic solution in an emergent situation. Euro Surveill  2007; 12: E5–6.

Unemo M, Clarke IN. The Swedish new variant of Chlamydia trachomatis. Curr Opin Infect Dis 2011; 24: 62–69.

Clarke IN, Hammas B, Beerens AMJ, Luijt DS, Westh H, Nilsson P, et al. Detection and spread of new variant Chlamydia trachomatis in northern European countries. Proceedings of the Twelfth International Symposium on Human Chlamydial Infections. Hof bei Salzburg,  Austria. June 20–25, 2010.

Lena Marions,Rotzen- Ostulan et al. High Occurrence of a New Variant of Chlamydia trachomatis Escaping Diagnostic Test Among STI Clinic Patients in Stockholm, Sweden. Sexually Transmitted Diseases, January 2008, Vol 35, No1, p.61-64.

Centers for Disease Control and Prevention Sexually Transmitted Disease Suveillance. 2009. Atlanta, USD Department Of Health and Human Services, 2010.

Handbook artus®C. trachomatis PlusRG PCR kit, Qiagen

Basel, Karger. Chlamydial Infection: A Clinical and Public Health Perspective. Issues Infect. Dis.2013, Vol 7. p, 78-88.

Cercenado E, SEIMC, Diagnóstico Microbiológico de las Infecciones por Chlamydia spp y especies realcionadas, 2012.

C-Y Chen,Alexander et al, A real time PCR quadriplex PCR assay for the diagnosis of rectal lynphogranuloma venereum and non- linphogranuloma venereum C. trachomatis infections, Sex Transm.Infect 2008;84:273-276.

Bjorn Herrmann, A new genetic variant of Chlamydia trachomatis. Sex. Transm Infect 2007 83: 253-254.

Bjorn Herrmann, Update on the new variant of Chlamydia trachomatis: Prevalence and Diagnostics, Eurosurveillance, vol 13.

Introducción

Chlamydia trachomatis es el agente de mayor prevalencia entre las Infecciones bacterianas de Transmisión Sexual (ITS), siendo las mujeres quienes transportan la mayor carga de la enfermedad. Estas mujeres son la fuente potencial de infección para sus parejas  sexuales.

C. trachomatis causa uretritis en el varón y cervicitis mucopurulenta, uretritis y endometritis en la mujer.

Las infecciones por C. trachomatis son asintomáticas en el 90% de las mujeres y en más del 50% de los varones. De esto surge la importancia de los programas de screening para intensificar el testeo.

La Organización Mundial de la Salud (OMS), en su último informe sobre la incidencia y prevalencia global de las infecciones curables de transmisión sexual del año 2008, muestra un total de nuevos casos por año en adultos entre 15 y 49 años de 105,5 millones de  casos de C. trachomatis.

La infección por C. trachomatis puede causar infertilidad en hombres y mujeres. El 10-15% de las mujeres con infecciones no tratadas desarrollarán Enfermedad Inflamatoria Pelviana (E.I.P.) u otra severa secuela como infertilidad o embarazo extrauterino.

La E.I.P. es usualmente el resultado de la infección ascendente desde el endocérvix causando endometritis, salpingitis, parametritis, abscesos tubáricos y peritonitis.

La infección ascendente durante el embarazo puede ocasionar ruptura de membranas, corioamnionitis, infección puerperal e infección neonatal (conjuntivitis y neumonía).

También se ha visto que estas infecciones conllevan un aumento de riesgo en el desarrollo de cáncer cérvico uterino.

Por otro lado varios estudios confirman que la infección por C. trachomatis del tracto genital facilita la transmisión de HIV. La posible interrelación entre  HIV y C. trachomatis incluye la patogénesis intracelular invasiva de C. trachomatis, causando daño sustancial del epitelio lo que facilita la infección HIV y a su vez los cambios debidos a la infección por HIV pueden favorecer la infección por C. trachomatis.

Las guías del CDC para la prevención y control de las ITS recomienda que toda mujer sexualmente activa menor a 25 años de edad y las mujeres mayores a 25 años con factores de riesgo deben ser rutinariamente tamizadas en búsqueda de C. trachomatis una vez al  año. También se recomienda el screening para las mujeres embarazadas para prevenir las infecciones verticales al neonato.

El Control de las ITS es una prioridad de Salud Pública

El diagnóstico temprano, tratamiento y notificación a las respectivas parejas son cruciales  para reducir la incidencia de nuevos casos de infección genital por Chlamydia trachomatis como así también la prevalencia de la infección.

Suecia tiene una larga historia de screening oportunístico para clamidia y mandatoria notificación a las parejas. Tanto los laboratorios como los médicos reportan a los centros de control de enfermedad nacional y regional respecto al número de casos diagnosticados y  casos clínicos individuales.

En un estado del sudoeste de Suecia se observó una disminución del 25% de las infecciones por C. trachomatis. Posteriormente se reveló una deleción en el plásmido críptico.

Una nueva variante de Chlamydia trachomatis (nvCT) fue  descubierta en Suecia cuando se secuenció el plásmido críptico, encontrándose una deleción de 377 pares de bases (pb) en el área target de los tests de detección empleados.

El Instituto Sueco para el Control de Enfermedades Infecciosas recomendó que en los estados que usaban estos tests, con un solo blanco de acción en el plásmido críptico, las muestras con sospecha de infección por clamidia fueran enviadas a un laboratorio de referencia para la detección de la cepa mutante. Se reportó 39% de la nueva variante y posteriormente la nueva variante fue encontrada en Dinamarca.

La historia de nvCT ha puesto de relieve la importancia de la vigilancia epidemiológica para la evidencia de cambios biológicos insospechados que tienen impacto sobre el diagnóstico de salud pública.

Para minimizar el riesgo de resultados falsos negativos los sistemas de detección deben contar con diferentes targets en la misma reacción del test.

El nuevo Gold Standard

Las técnicas de última generación, tecnologías de PCR en tiempo real (qPCR) con dos blancos omp1 y plásmido críptico.

artus®C. trachomatis PlusRG PCR kit se encuentra aprobado para la detección de C.trachomatis en muestras oculares, cervicales, uretrales, semen y muestras de orina.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El artus®C. trachomatis PlusRG PCR kit tiene dos dianas de detección para Chlamydia trachomatis una de 111 pb del plásmido críptico y otra de 106 pb del genoma en el gen ompA que codifica para la proteína de membrana externa MOMP.

La detección específica de ambos amplificados se ve en el canal de fluorescencia Green (FAM) del Rotor Gene Q (RGQ). Además este kit contiene un segundo sistema de amplificación heterólogo para detectar posible inhibición de PCR. Este Control Interno (CI) se detecta en el canal de fluorescencia Yellow (JOE) del Rotor gene Q ( RGQ) de Qiagen. Se incluye un Control Positivo externo.

El diagnóstico de C. trachomatis mediante qPCR se basa en la amplificación de estas regiones específicas previamente enunciadas. La detección del producto amplificado es mediante los fluorocromos acoplados a sondas de oligonucleótidos que van ligándose  específicamente a la secuencia que se amplifica.

En cuanto a la sensibilidad analítica es de 0,04 be/?l (p = 0,05). Esto significa que hay un 95% de posibilidades de que se detecten 0,04 be/?l.

Mientras que la sensibilidad analítica incluyendo el método de purificación mediante columnas QIAamp DNA Mini kit, Qiagen 300 be/mL (p = 0,05). Esto significa que hay un 95% de posibilidades de que se detecten 300 be/mL.

En cuanto a la especificidad, se controló la comparación de secuencias y se analizó la especificidad del kit frente a serovares relevantes de cepas ATCC de C. trachomatis.

También se analizó la especificidad del kit frente a posibles reacciones cruzadas con diferentes patógenos y ninguno de los agentes  patógenos sometidos a la prueba resultó reactivo.

C. trachomatis es uno de los patógenos de transmisión sexual más predominante a nivel mundial. No existen limitaciones técnicas para su diagnóstico, por lo que es posible estimar la verdadera prevalencia en nuestro medio, tener un diagnóstico oportuno y evitar las serias complicaciones de salud de una enfermedad silente.

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