Revista Bioreview Edición 60 - Agosto 2016

BIODIAGNOSTICO

 

Hemoglobina Glicosilada por HPLC

La diabetes mellitus es una enfermedad que se caracteriza por hiperglicemia a causa de la incapacidad del organismo de utilizar la glucosa en la sangre para producir energía. En la diabetes Tipo 1, el páncreas no fabrica insulina y, por tanto, la glucosa en la sangre no puede entrar en las células para ser utilizada como energía. En la diabetes Tipo 2, el páncreas no fabrica suficiente insulina o el organismo es incapaz de utilizarla  correctamente.

Los efectos directos e indirectos de la hiperglucemia sobre el sistema vascular humano son la fuente principal de morbimortalidad en la diabetes tanto de tipo 1 como de tipo 2. Entre estos efectos, se incluyen complicaciones macrovasculares (arteriopatía coronaria, arteriopatía periférica y apoplejía) y microvasculares (nefropatía diabética, neuropatía y retinopatía).

La diabetes mellitus afecta aproximadamente al 7% de la población mundial.

La terapia para la diabetes exige el mantenimiento a largo plazo de una glucemia que sea lo más cercana posible a la normal, a fin de reducir al mínimo el riesgo de complicaciones vasculares a largo plazo.

Una simple medida de la glucemia en ayunas sirve de indicación del estado del paciente en las horas previas, pero puede no ser representativa del verdadero estado de la regulación de la glucemia. La medición de hemoglobina A1c (HbA1c) cada dos o tres meses ha sido aceptada como medida de control de glucemia en la atención y el tratamiento de los pacientes con diabetes mellitus.

La hemoglobina es un compuesto químico constituido por un núcleo de hierro transportado por la sangre dentro de los glóbulos rojos, y permite la llegada del oxígeno a los tejidos del organismo. Los glóbulos rojos viven aproximadamente 120 días, y durante todo ese tiempo la hemoglobina sufre un proceso llamado glucosilación, que consiste en la incorporación de glucosa a su molécula. El aumento sostenido de la glucemia hace que la  glucosilación sea más intensa, y mayor el porcentaje de hemoglobina glucosilada con respecto a la hemoglobina normal.

Figura 1. The formation of HbA1c[6]

La hemoglobina glicosilada (hemoglobina A1c, Hb1c, HbA1c, o A1c) es un examen que mide la cantidad de hemoglobina que se glucosila en la  sangre, y brinda un buen estimado de qué tan bien está siendo tratada la diabetes mellitus (DM) durante los últimos 3 meses. En general, cuanto más alto sea el nivel de HbA1c, mayor será el riesgo para el paciente de desarrollar complicaciones oculares, renales, vasculares y de los nervios periféricos.bLas hemoglobinas glicosiladas pueden ser A1a, A1b y A1c. Estas hemoglobinas son producto de una pequeña modificación pos-sintética de la hemoglobina A. La hemoglobina A1c representa del 3 al 6 % de la hemoglobina total de los individuos sanos, y puede doblarse (e incluso triplicarse) en pacientes con DM según sus niveles de glucemia.

Existen varias técnicas para medir la fracción de la hemoglobina y los diferentes métodos analíticos detectan diversas fracciones de ésta: Cromatografía en columna, Métodos inmunológicos y Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), éste último utilizado en nuestro laboratorio (BIO-RAD D10).

El programa D-10 Hemoglobin A1c Program utiliza principios de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) por intercambio iónico. Las muestras se diluyen automáticamente en D-10 y se inyectan en el cartucho de análisis. El D-10 crea un gradiente de tampones programado de fuerza iónica  creciente en el cartucho, donde las hemoglobinas se separan en función de sus interacciones iónicas con el material del cartucho. Después, las  hemoglobinas así separadas atraviesan la célula de flujo del fotómetro, donde se miden los cambios de absorbancia a 415 nm.

El software del equipo D-10 procesa los datos reunidos en cada análisis. Se utilizan dos niveles de calibración para determinar cuantitativamente los valores de HbA1c. Para cada muestra se genera un informe y un cromatograma. El pico de A1c aparece sombreado. Esta área se calcula utilizando un algoritmo de Gauss modificado exponencialmente que excluye las áreas de picos de A1c lábil y hemoglobina carbamilada del área de picos de A1c.

Es posible establecer la trazabilidad del D-10 Hemoglobin A1c Program con los métodos de referencia del Programa nacional de estandarización de  glicohemoglobinas de EE. UU. (National Glycohemoglobin Standardization Program; NGSP) y la Federación Internacional de Química Clínica y Ciencias de Laboratorio Clínico (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; IFCC).

NGSP certifica la trazabilidad documentada del programa D-10 Hemoglobin A1c Program al método de referencia de Ensayo para el control y el estudio de las complicaciones de la diabetes (Diabetes Control and Complications Trial; DCCT). El objetivo de NGSP es normalizar los resultados de las pruebas de glicohemoglobina para que los resultados de los laboratorios clínicos sean comparables a los notificados por el DCCT, que ha establecido la relación entre los valores medios de glucemia y el riesgo de complicaciones vasculares.

El grupo de trabajo de IFCC dedicado a la estandarización de HbA1c ha elaborado y mantiene el procedimiento de medición de referencia para  HbA1c que debe utilizarse como ancla analítica para la trazabilidad de HbA1c.

Rangos de Hemoglobina A1c

Los siguientes rangos de HbA1c pueden utilizarse para interpretar resultados; no obstante, también deben tenerse en cuenta factores tales como la duración de la diabetes, el cumplimiento de la terapia y la edad del paciente para valorar el grado de control de la glucemia. Estos valores son para  mujeres no embarazadas.

La medida que debe tomarse depende de las circunstancias individuales de cada paciente. Entre estas medidas, se incluye mejorar su educación  para el autocontrol de la diabetes, compartir este control con un grupo de diabéticos, remitirlo a un endocrinólogo, modificar la terapia farmacológica, iniciar o aumentar el automonitorización de la glucemia o ver más a menudo al paciente.

Resultados de Hemoglobina A1c (%) y el grado de control de glucosa

  •  HbA1c > 8 % deben tomarse medidas
  •  Hb A1c < 7 % objetivo
  •  Hb A1c < 6 % No Diabético
  •  Elevado riesgo de desarrollar complicaciones a largo plazo como retinopatía, nefropatía, neuropatía y cardiopatía. La medida que debe  tomarse depende de las circunstancias individuales de cada paciente.
  •  Cierto riesgo de reacción hipoglucémica en diabetes Tipo 1. Algunos individuos con intolerancia a la glucosa y diabetes asintomática pueden mostrar niveles (elevados) de HbA1c en esta zona.

Intervalo de referencia para no diabéticos

Es entre el 4,27% y el 6,07% de HbA1c. 

Ventajas del Dosaje de HbA1c por HPLC

  •  Buen estimador de la glicemia crónica porque la glicación se produce a lo largo de la vida eritrocitaria.
  •  Baja variabilidad biológica intraindividual (<2%). No se afecta significativamente su concentración en periodos de tiempo cortos
  •  No se requieren muestras en ayuno ni cronometradas y tiene buena estabilidad preanalítica
  •  Uso de la HbA1c para el diagnóstico de la diabetes. Aplicación restringida al caso en el que se use un método certificado.
  •  Buena especificidad, con resultados rápidos de un volumen importante de pruebas, con instrumentos robustos, de alta eficiencia (automatizados).
  •  Excelente desempeño analítico con resultados altamente precisos y reproducibles, aún en muestras almacenadas en congelación (-70°C, hasta por 18 días, se presentan cambios, pero mínimos y sistemáticos(<0.35%)).

En muchos sistemas no se alteran los resultados por las hemoglobinas inestables ni por la hemoglobina carbamilada. Más que debilidad, es una fortaleza: el HPLC puede ser de utilidad para detectar hemoglobinopatías silentes!

Se cuenta con calibradores para cumplir con los acuerdos internacionales y los sistemas HPLC más recientes tienen muy buena linealidad  (Bio-Rad).

Los sistemas HPLC más recientes tienen una precisión intraensayo muy alta (CV < 1%), con precisión interensayo con CV <<< 2%.

Referencia Bibliográficas.

1. Peterson KP, JG Pavlovich. What is hemoglobin A1c? An analysis of glycated hemoglobins by electrospray ionization mass spectrometry. Clin Chem. 1998;44(9):1951-8.

2. Kilpatrick ES. Glycated haemoglobin in the year 2000. J Clin Pathol. 2000;53(5):335-9.

3. Michigan Diabetes Research & Training Center. Hemoglobin A1c Fact Sheet [citado 26 Dic 2007]. Disponible en: http://www.med.umich.edu/mdrtc/cores/ChemCore/hemoa1c.htm

4. Larsen ML, Hørder M, Mogensen EF. Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 1990;323(15):1021-5.

5. Rohlfing CL, RR Little. Use of GHb (HbA1c) in screening for undiagnosed diabetes in the U.S. population. Diabetes Care. 2000;23(2):187-91.

6. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes 2007. Diabetes Care. 2007;30(Suppl.1):4-41.

7. McCance DR, RL Hanson. Comparison of tests for glycated haemoglobin and fasting and two hour plasma glucose concentrations as diagnostic methods for diabetes. BMJ. 1994;308(6940):1323-8.

8. Engelgau MM, TJ Thompson. Comparison of fasting and 2-hour glucose and HbA1c levels for diagnosing diabetes. Diagnostic criteria and performance revisited. Diabetes Care. 1997;20(5):785-91.

9. Huisman TH, Martis EA, Dozy A. Chromatography of hemoglobin types on carboxymethylcellulose. J Lab Clin Med. 1958;52(2):312-27.

10. Bookchin RM, Gallop PM. Structure of hemoglobin A1c: nature of the N-terminal beta chain blocking group. Biochem Biophys Res Commun. 1968;32(1):86-93.

11. Rahbar S, Blumenfeld O, Ranney HM. Studies of an unusual hemoglobin in patients with diabetes mellitus. Biochem Biophys Res Commun. 1969;36(5):838-43.

12. Bunn HF, Haney DN, Gabbay KH, Gallop PM. Further identification of the nature and linkage of the carbohydrate in hemoglobin A1c. Biochem Biophys Res Commun. 1975;67(1):103-9.

13. Koenig RJ, Peterson CM, Jones RL, Saudek C, Lehrman M, Cerami A . Correlation of glucose regulation and hemoglobin AIc in diabetes mellitus. N Engl J Med. 1976;295(8):417-20.

14. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. N Engl J Med. 2000; Feb 10; 342(6):381-9. Erratum in: N Engl J Med. 2000 May 4;342(18):1376.

15. The International Expert Committee. International expert committee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care. 2009;32(7):1-8.

16. The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Follow-up report on the diagnosis of diabetes mellitus. Diabetes Care. 2003;26:3160-7.

 

La diabetes mellitus es una enfermedad que se caracteriza por hiperglicemia a causa de la incapacidad del organismo de utilizar la glucosa en la sangre para producir energía. En la diabetes Tipo 1, el páncreas no fabrica insulina y, por tanto, la glucosa en la sangre no puede entrar en las células para ser utilizada como energía. En la diabetes Tipo 2, el páncreas no fabrica suficiente insulina o el organismo es incapaz de utilizarla  correctamente.

Los efectos directos e indirectos de la hiperglucemia sobre el sistema vascular humano son la fuente principal de morbimortalidad en la diabetes tanto de tipo 1 como de tipo 2. Entre estos efectos, se incluyen complicaciones macrovasculares (arteriopatía coronaria, arteriopatía periférica y apoplejía) y microvasculares (nefropatía diabética, neuropatía y retinopatía).

La diabetes mellitus afecta aproximadamente al 7% de la población mundial.

La terapia para la diabetes exige el mantenimiento a largo plazo de una glucemia que sea lo más cercana posible a la normal, a fin de reducir al mínimo el riesgo de complicaciones vasculares a largo plazo.

Una simple medida de la glucemia en ayunas sirve de indicación del estado del paciente en las horas previas, pero puede no ser representativa del verdadero estado de la regulación de la glucemia. La medición de hemoglobina A1c (HbA1c) cada dos o tres meses ha sido aceptada como medida de control de glucemia en la atención y el tratamiento de los pacientes con diabetes mellitus.

La hemoglobina es un compuesto químico constituido por un núcleo de hierro transportado por la sangre dentro de los glóbulos rojos, y permite la llegada del oxígeno a los tejidos del organismo. Los glóbulos rojos viven aproximadamente 120 días, y durante todo ese tiempo la hemoglobina sufre un proceso llamado glucosilación, que consiste en la incorporación de glucosa a su molécula. El aumento sostenido de la glucemia hace que la  glucosilación sea más intensa, y mayor el porcentaje de hemoglobina glucosilada con respecto a la hemoglobina normal.

Figura 1. The formation of HbA1c[6]

La hemoglobina glicosilada (hemoglobina A1c, Hb1c, HbA1c, o A1c) es un examen que mide la cantidad de hemoglobina que se glucosila en la  sangre, y brinda un buen estimado de qué tan bien está siendo tratada la diabetes mellitus (DM) durante los últimos 3 meses. En general, cuanto más alto sea el nivel de HbA1c, mayor será el riesgo para el paciente de desarrollar complicaciones oculares, renales, vasculares y de los nervios periféricos.bLas hemoglobinas glicosiladas pueden ser A1a, A1b y A1c. Estas hemoglobinas son producto de una pequeña modificación pos-sintética de la hemoglobina A. La hemoglobina A1c representa del 3 al 6 % de la hemoglobina total de los individuos sanos, y puede doblarse (e incluso triplicarse) en pacientes con DM según sus niveles de glucemia.

Existen varias técnicas para medir la fracción de la hemoglobina y los diferentes métodos analíticos detectan diversas fracciones de ésta: Cromatografía en columna, Métodos inmunológicos y Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), éste último utilizado en nuestro laboratorio (BIO-RAD D10).

El programa D-10 Hemoglobin A1c Program utiliza principios de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) por intercambio iónico. Las muestras se diluyen automáticamente en D-10 y se inyectan en el cartucho de análisis. El D-10 crea un gradiente de tampones programado de fuerza iónica  creciente en el cartucho, donde las hemoglobinas se separan en función de sus interacciones iónicas con el material del cartucho. Después, las  hemoglobinas así separadas atraviesan la célula de flujo del fotómetro, donde se miden los cambios de absorbancia a 415 nm.

El software del equipo D-10 procesa los datos reunidos en cada análisis. Se utilizan dos niveles de calibración para determinar cuantitativamente los valores de HbA1c. Para cada muestra se genera un informe y un cromatograma. El pico de A1c aparece sombreado. Esta área se calcula utilizando un algoritmo de Gauss modificado exponencialmente que excluye las áreas de picos de A1c lábil y hemoglobina carbamilada del área de picos de A1c.

Es posible establecer la trazabilidad del D-10 Hemoglobin A1c Program con los métodos de referencia del Programa nacional de estandarización de  glicohemoglobinas de EE. UU. (National Glycohemoglobin Standardization Program; NGSP) y la Federación Internacional de Química Clínica y Ciencias de Laboratorio Clínico (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine; IFCC).

NGSP certifica la trazabilidad documentada del programa D-10 Hemoglobin A1c Program al método de referencia de Ensayo para el control y el estudio de las complicaciones de la diabetes (Diabetes Control and Complications Trial; DCCT). El objetivo de NGSP es normalizar los resultados de las pruebas de glicohemoglobina para que los resultados de los laboratorios clínicos sean comparables a los notificados por el DCCT, que ha establecido la relación entre los valores medios de glucemia y el riesgo de complicaciones vasculares.

El grupo de trabajo de IFCC dedicado a la estandarización de HbA1c ha elaborado y mantiene el procedimiento de medición de referencia para  HbA1c que debe utilizarse como ancla analítica para la trazabilidad de HbA1c.

Rangos de Hemoglobina A1c

Los siguientes rangos de HbA1c pueden utilizarse para interpretar resultados; no obstante, también deben tenerse en cuenta factores tales como la duración de la diabetes, el cumplimiento de la terapia y la edad del paciente para valorar el grado de control de la glucemia. Estos valores son para  mujeres no embarazadas.

La medida que debe tomarse depende de las circunstancias individuales de cada paciente. Entre estas medidas, se incluye mejorar su educación  para el autocontrol de la diabetes, compartir este control con un grupo de diabéticos, remitirlo a un endocrinólogo, modificar la terapia farmacológica, iniciar o aumentar el automonitorización de la glucemia o ver más a menudo al paciente.

Resultados de Hemoglobina A1c (%) y el grado de control de glucosa

  •  HbA1c > 8 % deben tomarse medidas
  •  Hb A1c < 7 % objetivo
  •  Hb A1c < 6 % No Diabético
  •  Elevado riesgo de desarrollar complicaciones a largo plazo como retinopatía, nefropatía, neuropatía y cardiopatía. La medida que debe  tomarse depende de las circunstancias individuales de cada paciente.
  •  Cierto riesgo de reacción hipoglucémica en diabetes Tipo 1. Algunos individuos con intolerancia a la glucosa y diabetes asintomática pueden mostrar niveles (elevados) de HbA1c en esta zona.

Intervalo de referencia para no diabéticos

Es entre el 4,27% y el 6,07% de HbA1c. 

Ventajas del Dosaje de HbA1c por HPLC

  •  Buen estimador de la glicemia crónica porque la glicación se produce a lo largo de la vida eritrocitaria.
  •  Baja variabilidad biológica intraindividual (<2%). No se afecta significativamente su concentración en periodos de tiempo cortos
  •  No se requieren muestras en ayuno ni cronometradas y tiene buena estabilidad preanalítica
  •  Uso de la HbA1c para el diagnóstico de la diabetes. Aplicación restringida al caso en el que se use un método certificado.
  •  Buena especificidad, con resultados rápidos de un volumen importante de pruebas, con instrumentos robustos, de alta eficiencia (automatizados).
  •  Excelente desempeño analítico con resultados altamente precisos y reproducibles, aún en muestras almacenadas en congelación (-70°C, hasta por 18 días, se presentan cambios, pero mínimos y sistemáticos(<0.35%)).

En muchos sistemas no se alteran los resultados por las hemoglobinas inestables ni por la hemoglobina carbamilada. Más que debilidad, es una fortaleza: el HPLC puede ser de utilidad para detectar hemoglobinopatías silentes!

Se cuenta con calibradores para cumplir con los acuerdos internacionales y los sistemas HPLC más recientes tienen muy buena linealidad  (Bio-Rad).

Los sistemas HPLC más recientes tienen una precisión intraensayo muy alta (CV < 1%), con precisión interensayo con CV <<< 2%.

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