Revista Bioreview Edición 40 - Diciembre 2014

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Variantes de baja penetrancia de los genes FGFR2 MAP3k1 y su asociación con el riesgo para el cáncer de mama en población chilena

¹Kerube Cerceño, ¹Lilian Jara, ²Patricio Gonzàlez-Hormazàbal
¹Escuela de medicina,Universidad de Chile. Santiago, Chile
Revista Panameña de Laboratorio Clínico e Investigación: Vol 4, N°2, Agosto de 2013

Abstract

Breast cancer (BC) is one of the major health problems of woman worldwide. Risk factors attributable to the development of disease include: age, ethnicity, hormonal exposure and genetic factors, being the latter the most important. Current model proposed to explain genetic susceptibility to BC is the polygenic one, and includes the involvement of high, moderate and low-penetrance genes. 

Low- penetrance genes FGFR2 and MAP3K1 presented the highest associations with increased risk of BC. FGFR2 gene encodes growth factor receptor and MAP3K1 gene encodes serine/ threonine  kinase, member of mitogen activated kinases (MAPK). The event downstream of FGFR2 activation pathway includes the MAPK pathway. In addition of their individual effect, is postulated that the interaction between both genes may increase the risk of BC.

Recently, many studies have been conducted in women from European, Asian and African origin in  which differences in risk estimates to BC could be attributable to differences in genetic structure.

Currently in Chile and other South American populations, there are not studies analyzing low-penetrance BC genes with increase risk of familial BC. The completion of these studies could help to understand the genetic basis of susceptibility of BC in this population.

This study show the association with BC risk of low-penetrance variants rs1219648, rs2981582 and rs2420946 (FGFR2 gene) and rs889312 (MAP3K1 gene), and the interaction between both  genes. A case- control study was performed in 307 cases of familial BC BRCA1/2 negative and 614 healthy controls without familial BC history. Genotyping was performed using 5’Exonuclease Taqman® assay. The results showed that the risk allele frequencies of FGFR2 variants were higher in cases (values between 0.48 and 0.49 for the three SNPs of FGFR2 gene) compared to controls (value of 0.40 for the three SNPs).

The FGFR2 gene variants were associated with increased risk of BC in homozygous for the risk allele (rs1219648 GG OR= 1.83[CI 95% 1.2 – 2.8]; rs2981582 TT OR= 1.91[CI95% 1.3 – 2.9]; rs2420946 TT OR= 2.03[CI95% 1.3 – 3.1]) for the complete sample. After stratification by family history, the highest associations were for the risk homozygous of SNP’s rs1219648 and rs2420946 (OR=2.15 [CI95% 1.1 – 4.1] and OR= 2.27 [CI95% 1.2 – 4.2], respectively) in BC cases without  family history diagnosed at age ?50 years.

For SNP rs889312 (MAP3K1 gene), results showed that risk allele was higher in cases (0.45)  compared with controls (0.36) of entire sample. Also, after stratification by family history, the  highest association was for the risk homozygote CC (OR= 2.40 [CI95% 1.3 – 4.4]) in BC ases without family history diagnosed at age ?50 years. Currently in Panamanian population, there’s  not any study in FGFR2 and MAP3K1 genes related to BC.

Resumen

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer  actual. Los factores de riesgo atribuibles al desarrollo de la enfermedad incluyen: edad, etnia, exposición hormonal y factores genéticos siendo este último el más importante.

El modelo actualmente propuesto para explicar la susceptibilidad genética al CM es poligénico e  incluye la participación de genes de alta, moderada y baja penetrancia. De los genes de baja  penetrancia FGFR2 y MAP3K1 han presentado las mayores asociaciones con el aumento del riesgo a CM. El gen FGFR2 codifica para un receptor de factor de crecimiento y el gen MAP3K1, codifica para una serina /treonina quinasa, integrante del grupo de quinasas activadoras de  citógenos (MAPK). La cascada de eventos río abajo de la vía de activación del FGFR2 incluye a la  vía de las MAPK. Además de su efecto individual, se postula que la interacción entre estos genes podría aumentar el riesgo a CM. A la fecha, los estudios de susceptibilidad que vinculan a FGFR2 y MAP3K1 con CM, se han realizado en mujeres de origen europeo, asiático y afroamericano en las cuales las diferencias en las estimaciones de riesgo a CM podrían ser atribuibles a diferencias en la estructura genética de cada población.

Actualmente, en Chile y en otras poblaciones Sudamericanas no existen estudios que relacionen  los loci de susceptibilidad de baja penetrancia con aumento del riesgo a CM familiar. La realización de estos estudios ayudaría a comprender las bases genéticas de la susceptibilidad al  CM en esta población.

En este trabajo se estudió las variantes de los genes de baja penetrancia rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 y su asociación con el riesgo para CM y la  interacción entre ambos genes con la susceptibilidad a la enfermedad. El estudio caso control de las variantes se realizó en un total de 307 casos de CM familiar BRCA1/2 negativo y 614 controles sanos sin antecedentes de CM mediante el ensayo 5’Exonucleasa (Taqman®). Los resultados indicaron que las frecuencias del alelo de riesgo de las variantes del gen FGFR2 fueron mayores en los casos (valores entre 0,48 y 0,49 para los tres SNPs), en comparación con los controles (valor de 0,40 para los tres SNPs). Las variantes del gen FGFR2 se asociaron con el aumento del riesgo para CM en los individuos homocigotos para el alelo de riesgo (rs1219648 GG OR=  1,83[IC95% 1,2 – 2,8]; rs2981582 TT OR= 1,91[IC95% 1,3 – 2,9]; rs2420946 TT OR=2,03[IC95% 1,3 – 3,1]) en la muestra completa. En la estratificación por historia familiar, las mayores asociaciones fueron para los homocigotos de riesgo de los SNPs rs1219648 y rs2420946 (OR= 2,15[IC95% 1,1 – 4,1] y OR= 2,27[IC95% 1,2 – 4,2], respectivamente) en los casos de CM sin historia familiar de CM y diagnosticados a edad ? 50 años. Para la variante rs889312 del gen MAP3K1, los resultados indicaron que el alelo de riesgo fue mayor en los casos (0,45) en  comparación con los controles (0,36) en la muestra completa.

Igualmente en la estratificación por historia familiar, la mayor asociación la presentó el  homocigoto de riesgo CC (OR=2,40[IC95% 1,3 – 4,4]) en los casos de CM sin historia familiar diagnosticados a edad ? 50 años. Actualmente en la población panameña, no se han hecho estudios de los genes FGFR2 y MAP3K1, en relación a cáncer de mama.

Introducción

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer  actual. En Chile, presenta la primera tasa de mortalidad por cáncer en mujeres (15,8/100,000 mujeres) desplazando al cáncer de vesícula y vía biliares (15,3 /100.000 mujeres) que hace algunos años atrás ocupaba el primer lugar (1). Se ha estimado que 5-15% de todos los CM presentan agregación familiar (2, 3).

En los años 90’ se identificaron dos genes de susceptibilidad para cáncer de mama: BRCA1 y BRCA2 (4, 5, 6). Los genes BRCA1/2 son de alta penetrancia e inicialmente fueron considerados los más importantes en la susceptibilidad genética al CM familiar. Sin embargo, la literatura ha  informado que las mutaciones germinales en BRCA1/2 sólo explican aproximadamente el 20% del CM familiar y la frecuencia de mutaciones de estos genes es muy baja en la población general (7). Actualmente, la literatura plantea que el modelo poligénico es el que mejor explica el riesgo  de CM en los casos con agregación familiar de la enfermedad (8). Este modelo plantea que la susceptibilidad genética al CM se explica por mutaciones en BRCA1/2 y por un número mucho mayor de mutaciones en genes de moderada y baja penetrancia.

Los genes de moderada y baja penetrancia se asocian con aumentos moderados o bajos del  riesgo y frecuencia poblacional es alta (> 0.05) (9). En los últimos años, los Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS, de sus siglas en inglés Genome Wide Association Studies) han identificado alelos de baja penetrancia asociados al CM.

En un GWAS, el grupo de Easton et al., (10) identificó 5 loci de susceptibilidad asociados con aumento del riesgo para CM en los genes FGFR2, TNRC9 /TOX3, MAP3K1 y LSP1.

El Receptor del Factor de Crecimiento Fibroblástico 2 (FGFR2) es un receptor con actividad tirosina  quinasa intrínseca (11). El FGFR2 aumenta su expresión en las líneas celulares de CM y se encuentra amplificado y sobreexpresado en tumores mamarios (12,13). El gen FGFR2 en  humanos, se encuentra localizado en la región cromosómica 10q26 y tiene 21 exones (14).

Las variantes rs2981582, rs2420946, rs1219648, rs2981579 y rs11200014 (localizados también en  del intrón 2 del gen FGFR2) han sido objeto de estudio por diversos autores (10, 15, 16, 17, 18). El gen MAP3K1 se ubica en la región cromosómica 5q11.2 y codifica para la proteína MAP3K1 (proteína activadora de mitógenos quinasa 1).

Esta quinasa inicia la vía de señalización de las proteínas quinasa activadoras de mitógenos  (MAPK) que incluye Ras, Raf, Mek, y Erk, responsable de regular la transcripción de genes importantes en el cáncer. La relación del gen MAP3K1 se ha descrito en dos GWAS, específicamente la variante polimórfica rs889312 (10, 15).

Algunos autores han descrito la asociación entre el SNP rs889312 y el riesgo para CM (19, 20). En  su mayoría, los estudios relacionados con las variantes del gen FGFR2 y MAP3K1, se han realizado en poblaciones de diversas etnias. Sin embargo, es desconocida la contribución de estas variantes al CM en mujeres suramericanas. Por otro lado, muchos estudios incluyen casos de CM de inicio temprano sin historia familiar para CM (21).

En población chilena, 18% de los casos de CM BRCA1/2 tienen historia familiar para CM o cáncer de ovario (22); hay un importante porcentaje de los casos de CM negativos para BRCA1/2 sin  historia familiar. Por lo tanto, en el presente estudio se evaluó la asociación de las variantes de los genes FGFR2 y MA3K1 con el riesgo para CM en casos de CM con historia familiar y casos de inicio temprano sin historia familiar para CM.

Métodos

Se seleccionaron 307 casos de CM de familias con alto riesgo para CM y/o ovario. Todos los casos  fueron analizados para mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 y se seleccionaron sólo los  casos BRCA1/2 negativos. El grupo de los controles incluyó 604 mujeres sanas sin historia  personal ni familiar de CM. El grupo muestral fue eleccionado de los archivos del Servicio de Salud del Area Metropolitana de Santiago, Corporación Nacional del Cáncer (CONAC) y otros  servicios privados del área metropolitana de Santiago. Los casos incluidos en este estudio  presentan muestras de ancestros chilenos de varias generaciones atrás, dato que se obtuvo luego de la entrevista. Los participantes en el estudio firmaron un consentimiento informado. Este  estudio contó con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina, Universidad de  Chile y se encuentra en el marco de ejecución del proyecto FONDECYT 1110081 (23).

Genotipificación: Se extrajo el DNA genómico total de muestras de sangre periférica a los 307  casos y 604 controles utilizando la técnica de Chomczynski et al (24).

La genotipificación de los SNP rs2420946 (c.109+1899A>G), rs1219648 (g. 123346190A>G), rs2981582 (c.109+906T>C) del gen FGFR2 y rs889312 (g.6626243C>A) del gen MAP3K1, se llevó  a cabo utilizando el ensayo 5’ Exonucleasa (Taqman®).

La técnica consistió en la elaboración de una mezcla de reacción que incluyó DNA, Universal  Master Mix 2x de TaqMan® (Applied Biosystems®), Taqman ® SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems®) y agua libre de DNasa. Los cuatro ensayos se encuentran disponibles como  pruebas prediseñados por Applied Biosystems®. La reacción se realizó en un Equipo de PCR en  tiempo Real Step One (Applied Biosystems®). La discriminación alélica se realizó en el software step one V2.1 (Applied Biosystems®).

Análisis estadístico aplicado al estudio

Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas para casos controles y se determinó si estaban  en Equilibrio de Hardy-Weinberg usando un test de bondad de ajuste (x2) a través del programa  STATA versión 8.2. Se utilizó el test exacto de Fisher de una cola para comparar frecuencias  alélicas y genotípicas con significancia (p < 0,05). La fuerza de asociación se estimó utilizando la razón de posibilidades (OR, Odds ratio) con su intervalo de confianza al 95% con STATA 8.2.

Resultados

La tabla 1 presenta la distribución alélica y genotípica  de las variantes rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 en la muestra completa (n= 307) y en los subgrupos por historia familiar de CM(n=198) y sin historia familiar de CM < 50 años (n=109). La distribución de genotipos en los controles presentó valores de p mayor a 0,05.

La frecuencias genotípicas y alélicas de los genes FGFR2 y MAP3K1 difirieron significativamente en  los tres grupos y en comparación con los controles. En la muestra completa, las variantes del gen  FGFR2 y del MAP3K1, se asociaron significativamente con el aumento del riesgo para CM. En este mismo grupo, los homocigotos para el alelo de menor frecuencia se asociaron con el aumento de riesgo para CM (rs1219648, GG OR: 1,83[1,2 –2,8], p=<0,01), rs2981582 (TT OR: 1,91[1,3 – 2,9],p=<0,01), rs2420946 (TT OR: 2,03[1,3 – 3,1], p= <0,01) y rs889312 (CC OR: 2,10(1,4 – 3,1), p= 0,01). También se observó asociación con el aumento del riesgo para CM en los portadores del alelo de menor frecuencia (Tabla 1). Con respecto a estratificación por historia de CM familiar e inicio temprano de la enfermedad, se observó que la condición homocigótica para el alelo de riesgo de los tres SNPs del gen FGFR2 (rs1219648 GG, rs2981582 TT y rs2420946 TT) y del MAP3K1 (rs889312 CC) aumenta el riesgo para CM, en su mayoría, la fuerza es aún mayor en  los casos de CM sin historia familiar de CM de inicio temprano (Tabla 1).

En resumen y de acuerdo a los resultados observados para las variantes del gen FGFR2 y  MAP3K1, se sugiere que son necesarias ambas copias del alelo de riesgo para observar asociación con el aumento del riesgo para CM en población chilena.

Discusión

En la actualidad existen gran cantidad de trabajos cuya finalidad ha sido la identificación de los  genes que dan cuenta del porcentaje remanente de casos de CM negativo para mutaciones en los genes BRCA1/2 (10, 25,26). Gracias a los avances en los estudios se ha logrado conocer parte  de la predisposición genética subyacente en los casos de CM familiares y esporádicos BRCA1/2 negativo. Sin embargo, poco se conoce en población suramericana. En este estudio caso-control, evaluamos el impacto de los polimorfismos de los genes FGFR2 y MAP3K1 en casos negativos para BRCA1/2 en población chilena.

El gen FGFR2 es un gen supresor de tumores que puede sobre-expresarse y amplificarse en  células de tumores mamarios. En sus trabajos, Meyer et al (27) sugieren como mecanismo para  explicar el origen de la carcinogénes, que las variantes de secuencia en el intrón 2 entre ellas las variantes rs1219648, rs2420946 y rs2981582, están muy próximas a los sitios de unión para  factores de transcripción como Oct-1/Runx2 y a sitios putativos de unión del receptor de  estrógenos (RE) (10), lo cual condicionaría la sobreexpresión del gen FGFR2 en el CM.

En este estudio, se realizó una estratificación de la historia familiar de CM e inicio temprano de la  enfermedad, para observar la exposición de los diferentes grupos al factor de riesgo genético e  identificar el grupo de mayor riesgo. Se observó que los casos sin historia familiar de CM y  diagnosticados a edad ? 50 años, presentaron las mayores asociaciones con el aumento del riesgo para CM. A la fecha, son varios los estudios que han descrito la asociación de las variantes del intrón 2 del gen FGFR2 con el riesgo para CM (16). Otros estudios incluyen casos de origen afroamericano, japonés, y europeo que llegaron a las misma conclusiones (21, 28,29). Como se  ha mencionado, muchos son los autores que han logrado presentar diferencias en cuanto al  riesgo para el CM en individuos de diversas etnias.

Slattery et al (30) publicaron un estudio caso-control en donde incluyeron mujeres con CM esporádico tanto de origen hispánico como no hispánico procedentes del Suroeste de Estados Unidos. En sus observaciones las mujeres de origen hispánico presentaron mayor riesgo para CM. Probablemente las mujeres hispánicas fueron en su mayoría mexicanas residentes en Estados  Unidos, en las que es conocido el importante componente genético amerindio-español. Lo anterior, podría explicar las observaciones en mujeres chilenas que presentan un componente genético amerindio-español importante.

La población chilena es el resultado de la mezcla entre población amerindia y europea, en su  mayoría españoles con un grado de mezcla que se ha estimado en un 40% amerindio y 60%  europeo (31,32).

En relación al efecto biológico de la variante rs889312 en la carcinogénesis mamaria, esta  variante se encuentra en un bloque de desequilibrio de ligamiento de 280 kb en donde se  encuentra el gen MAP3K1. Por lo tanto, se podría sugerir que la asociación con el riesgo para CM  está relacionada con la vía de señalización en donde participa la proteína MAP3K.

Existen varios estudios que han llegado a las mismas conclusiones de este trabajo (16,19). La literatura ha planteado supuestos con el propósito de explicar el origen de las enfermedades de origen multifactorial, como el CM. Uno de estos supuestos sugiere que las variantes de genes que se encuentran comúnmente en la población con una frecuencia superior al 5% (33) son la causa; a diferencia de las enfermedades mendelianas que presentan fuerte agregación familiar y son causadas por alelos de alta penetrancia de origen monogénico. Los alelos de riesgo de los cuatro SNPs analizados en esta tesis son de baja penetrancia y presentan una frecuencia alélica alta. Lo  anterior, podría explicar las observaciones de los grupos con y sin historia familiar a CM.

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Abstract

Breast cancer (BC) is one of the major health problems of woman worldwide. Risk factors attributable to the development of disease include: age, ethnicity, hormonal exposure and genetic factors, being the latter the most important. Current model proposed to explain genetic susceptibility to BC is the polygenic one, and includes the involvement of high, moderate and low-penetrance genes. 

Low- penetrance genes FGFR2 and MAP3K1 presented the highest associations with increased risk of BC. FGFR2 gene encodes growth factor receptor and MAP3K1 gene encodes serine/ threonine  kinase, member of mitogen activated kinases (MAPK). The event downstream of FGFR2 activation pathway includes the MAPK pathway. In addition of their individual effect, is postulated that the interaction between both genes may increase the risk of BC.

Recently, many studies have been conducted in women from European, Asian and African origin in  which differences in risk estimates to BC could be attributable to differences in genetic structure.

Currently in Chile and other South American populations, there are not studies analyzing low-penetrance BC genes with increase risk of familial BC. The completion of these studies could help to understand the genetic basis of susceptibility of BC in this population.

This study show the association with BC risk of low-penetrance variants rs1219648, rs2981582 and rs2420946 (FGFR2 gene) and rs889312 (MAP3K1 gene), and the interaction between both  genes. A case- control study was performed in 307 cases of familial BC BRCA1/2 negative and 614 healthy controls without familial BC history. Genotyping was performed using 5’Exonuclease Taqman® assay. The results showed that the risk allele frequencies of FGFR2 variants were higher in cases (values between 0.48 and 0.49 for the three SNPs of FGFR2 gene) compared to controls (value of 0.40 for the three SNPs).

The FGFR2 gene variants were associated with increased risk of BC in homozygous for the risk allele (rs1219648 GG OR= 1.83[CI 95% 1.2 – 2.8]; rs2981582 TT OR= 1.91[CI95% 1.3 – 2.9]; rs2420946 TT OR= 2.03[CI95% 1.3 – 3.1]) for the complete sample. After stratification by family history, the highest associations were for the risk homozygous of SNP’s rs1219648 and rs2420946 (OR=2.15 [CI95% 1.1 – 4.1] and OR= 2.27 [CI95% 1.2 – 4.2], respectively) in BC cases without  family history diagnosed at age ?50 years.

For SNP rs889312 (MAP3K1 gene), results showed that risk allele was higher in cases (0.45)  compared with controls (0.36) of entire sample. Also, after stratification by family history, the  highest association was for the risk homozygote CC (OR= 2.40 [CI95% 1.3 – 4.4]) in BC ases without family history diagnosed at age ?50 years. Currently in Panamanian population, there’s  not any study in FGFR2 and MAP3K1 genes related to BC.

Resumen

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer  actual. Los factores de riesgo atribuibles al desarrollo de la enfermedad incluyen: edad, etnia, exposición hormonal y factores genéticos siendo este último el más importante.

El modelo actualmente propuesto para explicar la susceptibilidad genética al CM es poligénico e  incluye la participación de genes de alta, moderada y baja penetrancia. De los genes de baja  penetrancia FGFR2 y MAP3K1 han presentado las mayores asociaciones con el aumento del riesgo a CM. El gen FGFR2 codifica para un receptor de factor de crecimiento y el gen MAP3K1, codifica para una serina /treonina quinasa, integrante del grupo de quinasas activadoras de  citógenos (MAPK). La cascada de eventos río abajo de la vía de activación del FGFR2 incluye a la  vía de las MAPK. Además de su efecto individual, se postula que la interacción entre estos genes podría aumentar el riesgo a CM. A la fecha, los estudios de susceptibilidad que vinculan a FGFR2 y MAP3K1 con CM, se han realizado en mujeres de origen europeo, asiático y afroamericano en las cuales las diferencias en las estimaciones de riesgo a CM podrían ser atribuibles a diferencias en la estructura genética de cada población.

Actualmente, en Chile y en otras poblaciones Sudamericanas no existen estudios que relacionen  los loci de susceptibilidad de baja penetrancia con aumento del riesgo a CM familiar. La realización de estos estudios ayudaría a comprender las bases genéticas de la susceptibilidad al  CM en esta población.

En este trabajo se estudió las variantes de los genes de baja penetrancia rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 y su asociación con el riesgo para CM y la  interacción entre ambos genes con la susceptibilidad a la enfermedad. El estudio caso control de las variantes se realizó en un total de 307 casos de CM familiar BRCA1/2 negativo y 614 controles sanos sin antecedentes de CM mediante el ensayo 5’Exonucleasa (Taqman®). Los resultados indicaron que las frecuencias del alelo de riesgo de las variantes del gen FGFR2 fueron mayores en los casos (valores entre 0,48 y 0,49 para los tres SNPs), en comparación con los controles (valor de 0,40 para los tres SNPs). Las variantes del gen FGFR2 se asociaron con el aumento del riesgo para CM en los individuos homocigotos para el alelo de riesgo (rs1219648 GG OR=  1,83[IC95% 1,2 – 2,8]; rs2981582 TT OR= 1,91[IC95% 1,3 – 2,9]; rs2420946 TT OR=2,03[IC95% 1,3 – 3,1]) en la muestra completa. En la estratificación por historia familiar, las mayores asociaciones fueron para los homocigotos de riesgo de los SNPs rs1219648 y rs2420946 (OR= 2,15[IC95% 1,1 – 4,1] y OR= 2,27[IC95% 1,2 – 4,2], respectivamente) en los casos de CM sin historia familiar de CM y diagnosticados a edad ? 50 años. Para la variante rs889312 del gen MAP3K1, los resultados indicaron que el alelo de riesgo fue mayor en los casos (0,45) en  comparación con los controles (0,36) en la muestra completa.

Igualmente en la estratificación por historia familiar, la mayor asociación la presentó el  homocigoto de riesgo CC (OR=2,40[IC95% 1,3 – 4,4]) en los casos de CM sin historia familiar diagnosticados a edad ? 50 años. Actualmente en la población panameña, no se han hecho estudios de los genes FGFR2 y MAP3K1, en relación a cáncer de mama.

Introducción

El cáncer de mama (CM) constituye uno de los mayores problemas para la salud de la mujer  actual. En Chile, presenta la primera tasa de mortalidad por cáncer en mujeres (15,8/100,000 mujeres) desplazando al cáncer de vesícula y vía biliares (15,3 /100.000 mujeres) que hace algunos años atrás ocupaba el primer lugar (1). Se ha estimado que 5-15% de todos los CM presentan agregación familiar (2, 3).

En los años 90’ se identificaron dos genes de susceptibilidad para cáncer de mama: BRCA1 y BRCA2 (4, 5, 6). Los genes BRCA1/2 son de alta penetrancia e inicialmente fueron considerados los más importantes en la susceptibilidad genética al CM familiar. Sin embargo, la literatura ha  informado que las mutaciones germinales en BRCA1/2 sólo explican aproximadamente el 20% del CM familiar y la frecuencia de mutaciones de estos genes es muy baja en la población general (7). Actualmente, la literatura plantea que el modelo poligénico es el que mejor explica el riesgo  de CM en los casos con agregación familiar de la enfermedad (8). Este modelo plantea que la susceptibilidad genética al CM se explica por mutaciones en BRCA1/2 y por un número mucho mayor de mutaciones en genes de moderada y baja penetrancia.

Los genes de moderada y baja penetrancia se asocian con aumentos moderados o bajos del  riesgo y frecuencia poblacional es alta (> 0.05) (9). En los últimos años, los Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS, de sus siglas en inglés Genome Wide Association Studies) han identificado alelos de baja penetrancia asociados al CM.

En un GWAS, el grupo de Easton et al., (10) identificó 5 loci de susceptibilidad asociados con aumento del riesgo para CM en los genes FGFR2, TNRC9 /TOX3, MAP3K1 y LSP1.

El Receptor del Factor de Crecimiento Fibroblástico 2 (FGFR2) es un receptor con actividad tirosina  quinasa intrínseca (11). El FGFR2 aumenta su expresión en las líneas celulares de CM y se encuentra amplificado y sobreexpresado en tumores mamarios (12,13). El gen FGFR2 en  humanos, se encuentra localizado en la región cromosómica 10q26 y tiene 21 exones (14).

Las variantes rs2981582, rs2420946, rs1219648, rs2981579 y rs11200014 (localizados también en  del intrón 2 del gen FGFR2) han sido objeto de estudio por diversos autores (10, 15, 16, 17, 18). El gen MAP3K1 se ubica en la región cromosómica 5q11.2 y codifica para la proteína MAP3K1 (proteína activadora de mitógenos quinasa 1).

Esta quinasa inicia la vía de señalización de las proteínas quinasa activadoras de mitógenos  (MAPK) que incluye Ras, Raf, Mek, y Erk, responsable de regular la transcripción de genes importantes en el cáncer. La relación del gen MAP3K1 se ha descrito en dos GWAS, específicamente la variante polimórfica rs889312 (10, 15).

Algunos autores han descrito la asociación entre el SNP rs889312 y el riesgo para CM (19, 20). En  su mayoría, los estudios relacionados con las variantes del gen FGFR2 y MAP3K1, se han realizado en poblaciones de diversas etnias. Sin embargo, es desconocida la contribución de estas variantes al CM en mujeres suramericanas. Por otro lado, muchos estudios incluyen casos de CM de inicio temprano sin historia familiar para CM (21).

En población chilena, 18% de los casos de CM BRCA1/2 tienen historia familiar para CM o cáncer de ovario (22); hay un importante porcentaje de los casos de CM negativos para BRCA1/2 sin  historia familiar. Por lo tanto, en el presente estudio se evaluó la asociación de las variantes de los genes FGFR2 y MA3K1 con el riesgo para CM en casos de CM con historia familiar y casos de inicio temprano sin historia familiar para CM.

Métodos

Se seleccionaron 307 casos de CM de familias con alto riesgo para CM y/o ovario. Todos los casos  fueron analizados para mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 y se seleccionaron sólo los  casos BRCA1/2 negativos. El grupo de los controles incluyó 604 mujeres sanas sin historia  personal ni familiar de CM. El grupo muestral fue eleccionado de los archivos del Servicio de Salud del Area Metropolitana de Santiago, Corporación Nacional del Cáncer (CONAC) y otros  servicios privados del área metropolitana de Santiago. Los casos incluidos en este estudio  presentan muestras de ancestros chilenos de varias generaciones atrás, dato que se obtuvo luego de la entrevista. Los participantes en el estudio firmaron un consentimiento informado. Este  estudio contó con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina, Universidad de  Chile y se encuentra en el marco de ejecución del proyecto FONDECYT 1110081 (23).

Genotipificación: Se extrajo el DNA genómico total de muestras de sangre periférica a los 307  casos y 604 controles utilizando la técnica de Chomczynski et al (24).

La genotipificación de los SNP rs2420946 (c.109+1899A>G), rs1219648 (g. 123346190A>G), rs2981582 (c.109+906T>C) del gen FGFR2 y rs889312 (g.6626243C>A) del gen MAP3K1, se llevó  a cabo utilizando el ensayo 5’ Exonucleasa (Taqman®).

La técnica consistió en la elaboración de una mezcla de reacción que incluyó DNA, Universal  Master Mix 2x de TaqMan® (Applied Biosystems®), Taqman ® SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems®) y agua libre de DNasa. Los cuatro ensayos se encuentran disponibles como  pruebas prediseñados por Applied Biosystems®. La reacción se realizó en un Equipo de PCR en  tiempo Real Step One (Applied Biosystems®). La discriminación alélica se realizó en el software step one V2.1 (Applied Biosystems®).

Análisis estadístico aplicado al estudio

Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas para casos controles y se determinó si estaban  en Equilibrio de Hardy-Weinberg usando un test de bondad de ajuste (x2) a través del programa  STATA versión 8.2. Se utilizó el test exacto de Fisher de una cola para comparar frecuencias  alélicas y genotípicas con significancia (p < 0,05). La fuerza de asociación se estimó utilizando la razón de posibilidades (OR, Odds ratio) con su intervalo de confianza al 95% con STATA 8.2.

Resultados

La tabla 1 presenta la distribución alélica y genotípica  de las variantes rs1219648, rs2981582 y rs2420946 del gen FGFR2 y rs889312 del gen MAP3K1 en la muestra completa (n= 307) y en los subgrupos por historia familiar de CM(n=198) y sin historia familiar de CM < 50 años (n=109). La distribución de genotipos en los controles presentó valores de p mayor a 0,05.

La frecuencias genotípicas y alélicas de los genes FGFR2 y MAP3K1 difirieron significativamente en  los tres grupos y en comparación con los controles. En la muestra completa, las variantes del gen  FGFR2 y del MAP3K1, se asociaron significativamente con el aumento del riesgo para CM. En este mismo grupo, los homocigotos para el alelo de menor frecuencia se asociaron con el aumento de riesgo para CM (rs1219648, GG OR: 1,83[1,2 –2,8], p=<0,01), rs2981582 (TT OR: 1,91[1,3 – 2,9],p=<0,01), rs2420946 (TT OR: 2,03[1,3 – 3,1], p= <0,01) y rs889312 (CC OR: 2,10(1,4 – 3,1), p= 0,01). También se observó asociación con el aumento del riesgo para CM en los portadores del alelo de menor frecuencia (Tabla 1). Con respecto a estratificación por historia de CM familiar e inicio temprano de la enfermedad, se observó que la condición homocigótica para el alelo de riesgo de los tres SNPs del gen FGFR2 (rs1219648 GG, rs2981582 TT y rs2420946 TT) y del MAP3K1 (rs889312 CC) aumenta el riesgo para CM, en su mayoría, la fuerza es aún mayor en  los casos de CM sin historia familiar de CM de inicio temprano (Tabla 1).

En resumen y de acuerdo a los resultados observados para las variantes del gen FGFR2 y  MAP3K1, se sugiere que son necesarias ambas copias del alelo de riesgo para observar asociación con el aumento del riesgo para CM en población chilena.

Discusión

En la actualidad existen gran cantidad de trabajos cuya finalidad ha sido la identificación de los  genes que dan cuenta del porcentaje remanente de casos de CM negativo para mutaciones en los genes BRCA1/2 (10, 25,26). Gracias a los avances en los estudios se ha logrado conocer parte  de la predisposición genética subyacente en los casos de CM familiares y esporádicos BRCA1/2 negativo. Sin embargo, poco se conoce en población suramericana. En este estudio caso-control, evaluamos el impacto de los polimorfismos de los genes FGFR2 y MAP3K1 en casos negativos para BRCA1/2 en población chilena.

El gen FGFR2 es un gen supresor de tumores que puede sobre-expresarse y amplificarse en  células de tumores mamarios. En sus trabajos, Meyer et al (27) sugieren como mecanismo para  explicar el origen de la carcinogénes, que las variantes de secuencia en el intrón 2 entre ellas las variantes rs1219648, rs2420946 y rs2981582, están muy próximas a los sitios de unión para  factores de transcripción como Oct-1/Runx2 y a sitios putativos de unión del receptor de  estrógenos (RE) (10), lo cual condicionaría la sobreexpresión del gen FGFR2 en el CM.

En este estudio, se realizó una estratificación de la historia familiar de CM e inicio temprano de la  enfermedad, para observar la exposición de los diferentes grupos al factor de riesgo genético e  identificar el grupo de mayor riesgo. Se observó que los casos sin historia familiar de CM y  diagnosticados a edad ? 50 años, presentaron las mayores asociaciones con el aumento del riesgo para CM. A la fecha, son varios los estudios que han descrito la asociación de las variantes del intrón 2 del gen FGFR2 con el riesgo para CM (16). Otros estudios incluyen casos de origen afroamericano, japonés, y europeo que llegaron a las misma conclusiones (21, 28,29). Como se  ha mencionado, muchos son los autores que han logrado presentar diferencias en cuanto al  riesgo para el CM en individuos de diversas etnias.

Slattery et al (30) publicaron un estudio caso-control en donde incluyeron mujeres con CM esporádico tanto de origen hispánico como no hispánico procedentes del Suroeste de Estados Unidos. En sus observaciones las mujeres de origen hispánico presentaron mayor riesgo para CM. Probablemente las mujeres hispánicas fueron en su mayoría mexicanas residentes en Estados  Unidos, en las que es conocido el importante componente genético amerindio-español. Lo anterior, podría explicar las observaciones en mujeres chilenas que presentan un componente genético amerindio-español importante.

La población chilena es el resultado de la mezcla entre población amerindia y europea, en su  mayoría españoles con un grado de mezcla que se ha estimado en un 40% amerindio y 60%  europeo (31,32).

En relación al efecto biológico de la variante rs889312 en la carcinogénesis mamaria, esta  variante se encuentra en un bloque de desequilibrio de ligamiento de 280 kb en donde se  encuentra el gen MAP3K1. Por lo tanto, se podría sugerir que la asociación con el riesgo para CM  está relacionada con la vía de señalización en donde participa la proteína MAP3K.

Existen varios estudios que han llegado a las mismas conclusiones de este trabajo (16,19). La literatura ha planteado supuestos con el propósito de explicar el origen de las enfermedades de origen multifactorial, como el CM. Uno de estos supuestos sugiere que las variantes de genes que se encuentran comúnmente en la población con una frecuencia superior al 5% (33) son la causa; a diferencia de las enfermedades mendelianas que presentan fuerte agregación familiar y son causadas por alelos de alta penetrancia de origen monogénico. Los alelos de riesgo de los cuatro SNPs analizados en esta tesis son de baja penetrancia y presentan una frecuencia alélica alta. Lo  anterior, podría explicar las observaciones de los grupos con y sin historia familiar a CM.

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