Revista para laboratorio diagnóstico clínico, bioquímico y molecular

Caracterización citogenética y molecular de una paciente ecuatoriana con cromosoma 4 en anillo: análisis clínico comparativo con 37 casos internacionales

◦ Arrays de ADN

◦ cariotipo

◦ Cromosoma 4

◦ Cromosomas en anillo

◦ Hibridación in situ fluorescente (FISH)

◦ Reporte de caso

◦ Revisión

Ana Proaño (1) Paola E. Leone (1) Ma. Eugenia Sánchez (1) Stella D. Verdezoto (1) Juan Luis García (2)
Jesús María Hernández (2) César Paz-y-Miño (1)
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas. Universidad de las Américas. Quito, Ecuador.
2 Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca – Instituto de Estudios de Ciencias de Salud de Castilla y León. Salamanca, España.
Correspondencia:
César Paz-y-Miño, M.D. Instituto de Investigaciones Biomédicas. Universidad de las Américas. José Queri S/N y Av Granados, Bloque 5, 2° piso.
Quito. Tel. 3970073 Fax. 3340229
E-mail: cesar.pazymino@udla.edu.ec
Forma de citar este artículo:
Proaño A, Leone PE, Sánchez ME, Verdezoto SD, García JL, Hernández JM, Paz-y-Miño C. Caracterización citogenética y molecular de una
paciente ecuatoriana con cromosoma 4 en anillo: análisis clínico comparativo con 37 casos internacionales. Rev Med Vozandes 2014; 25: 7 – 22

Resumen

Contexto

Los cromosomas en anillo son alteraciones genéticas muy inusuales, consecuencia de deleciones en las regiones terminales y de la unión de los extremos expuestos del cromosoma afectado. En un cromosoma 4 en anillo las regiones que con más frecuencia se afectan son 4p16.3 del brazo corto y 4q35.2 del brazo largo.

Sujeto y métodos

Se presenta el caso de una paciente con cromosoma 4 en anillo diagnosticado cuando tenía diez días de edad. Al examen clínico presentó dismorfogénesis importante: frente plana, nariz puntiforme, implantación baja de pabellones auriculares, clinodactilia del quinto dedo, microcefalia, micrognatia, un orificio en la región lumbosacra, estatura baja y retardo mental leve. A los 10 años de edad se le realizó una evaluación citogenética con técnicas más modernas: hibridación in situ fluorescente (FISH) y mapeo genético por arrays de ADN. El fenotipo de la paciente fue comparado con 37 casos reportados en la literatura internacional.

Resultados

En el análisis clínico de la paciente y los 37 casos internacionales se encontró alrededor de 41 características clínicas diferentes y variables en cada sujeto. Las más frecuentes fueron retraso en el crecimiento (78%), microcefalia (67%), retardo mental (62%), bajo peso al nacer (48%), clinodactilia del quinto dedo (37%), micrognatia (29%), hipertelorismo (21%) y alguna cardiopatía (18%). El estudio citogenético de la paciente a los diez días de edad mostró un cariotipo en mosaico 46,XX/46,XX,r(4) con anillo del cromosoma 4 en el 80% de las metafases. A los diez años de edad se encontró r(4) en el 90% de las células. El análisis por FISH reveló un cariotipo 46,XX,r(4). ishr(4)(p16.3q35.2)(492870-793359-,190183811- 190408149-). Los arrays evidenciaron las regiones de pérdida de los brazos cortos y largos del cromosoma 4 involucrados en la formación del anillo. Los genes que con seguridad inciden en el fenotipo de la paciente en estudio son LETM1, WHSC1, WHSC2, MIR943, TACC3, IDUA, C4orf48 para retardo mental; LETM1 y WHSC1 para microcefalia y KIAA1530 para retraso en el crecimiento.

Conclusión

El progreso en el diagnóstico genético a través de los hallazgos clínicos, citogenéticos y moleculares, ha permitido un mejor entendimiento de los síndromes genéticos. Las reestructuraciones cromosómicas que dan lugar a un cromosoma 4 en anillo presentan un patrón similar en relación a la pérdida de las regiones teloméricas y su posterior rearreglo; sin embargo el fenotipo de los pacientes es muy variado. Este trabajo es una nueva contribución a la ciencia, porque es el primer estudio que reporta una paciente ecuatoriana con cromosoma 4 en anillo aplicando técnicas citogenéticas y moleculares avanzadas para comprender el comportamiento clínico y la base genética de esta rara patología.

Palabras clave: Cromosomas en anillo, Cromosoma 4, Cariotipo, Hibridación in situ fluorescente (FISH), Arrays de ADN, Reporte de caso, Revisión.

Abstract

Context

Ring chromosomes are rare chromosomal structure abnormalities; they are formed when a chromosomal deletion leads to the fusion of both ends of the chromosome. The most frequent altered regions in ring chromosome 4 are 4p16.3 in short arm and 4q35.2 in long arm.

Subject and methods

Here we report a 10 days old female patient whose first cytogenetic diagnosis showed a ring chromosome 4. Clinical examination showed congenital abnormalities including flattened forehead, prominent nose, low set ears, clinodactyly of the fifth finger, microcephaly, micrognathia, small sacrococcygeal dimple, short stature and mild mental retardation. At the aged of ten fluorescence in situ hybridization (FISH) and DNA microarrays were performed. Finally, patient phenotype was compared with other 37 cases reported in the literature.

Results

The clinical analysis between the patient and the 37 cases reported showed about 41 different clinical features that vary between each individual. The most frequent features were growth retardation (78%), microcephaly (67%), mental retardation (62%), short stature at birth (48%), clinodactyly of the fifth finger (37%), micrognathia (29%), hypertelorism (21%) and some type of cardiopathy (18%). Chromosome analysis of the patient at 10 days old appeared as a chromosomal mosaicism 46,XX/46,XX,r(4), with ring chromosome 4 in 80% of the metaphases analyzed. At 10 years old of the patient it was observed r(4) in 90% of the cells. FISH analysis showed a karyotype 46,XX,r(4).ish r(4)(p16.3q35.2) (492870-793359-,190183811-190408149-). The arrays showed deleted regions at the short and long arms of chromosome 4 involved in the formation of ring chromosome. The genes that are manifested in the patient phenotype are LETM1, WHSC1, WHSC2, MIR943, TACC3, IDUA, C4orf48 for mental retardation; LETM1 y WHSC1 for microcephaly and KIAA1530 for growth retardation.

Conclusion

The progress in genetic diagnosis using clinical, cytogenetic and molecular tools has allowed a better understanding of genetic syndromes. Chromosomal rearrangements leading the formation of a ring chromosome 4 showed a similar pattern as the loss of telomeric regions and subsequent fusion of the breaking points; however the phenotype of patients varies widely. This work is a new contribution to science because this study is the first report of an Ecuadorian patient with a ring chromosome 4 which took into account several molecular and cytogenetic analyses. The findings will help to gain a better understanding of the clinical behavior and genetic basis.

Introducción

Los cromosomas en anillo son considerados una anormalidad genética rara en los seres humanos [1–3], que se producen por varios mecanismos citogenéticos como: roturas en un brazo del cromosoma seguido de una fusión de esa porción terminal con la región telomérica opuesta, roturas en un brazo del cromosoma seguido de una unión de esa porción terminal con la región subtelomérica opuesta, fusión de las dos regiones teloméricas opuestas o fusión entre las dos regiones subteloméricas opuestas [4–7]; provocando pérdida del material genético y fenotipos alterados. El fenotipo general de esta alteración genética muestra retardo en el crecimiento y microcefalia; en algunos casos se reporta implantación baja de pabellones auriculares, nariz puntiforme, micrognatia, pliegues epicánticos, paladar hendido, clinodactilia, cifosis, escoliosis, orificio en la región lumbosacra y disminución del tono muscular; adicionalmente, los pacientes pueden presentar retardo mental [8 – 44]. Desde 1969, se han reportado alrededor del mundo aproximadamente 37 casos de cromosoma 4 en anillo [8–44], lo que la hace una alteración de interés investigativo.

A continuación se presenta el caso de una paciente que acudió a la consulta por dos ocasiones (a los diez días y diez años de edad) y se le realizó una evaluación clínico-genética, empleando en su segundo control técnicas más modernas: hibridación in situ fluorescente (FISH) y mapeo genético por arrays. Además, se compara su fenotipo con las características clínicas descritas en los casos de cromosoma 4 en anillo reportados internacionalmente.

Sujeto y métodos

Presentación del caso en estudio

El sujeto de estudio fue una paciente femenina de diez años de edad, producto de una tercera gestación, de padres sanos sin anormalidades conocidas. La madre -aparentemente sana- presentó amenaza de aborto e infección a las vías urinarias en el primer trimestre de embarazo. El resto de antecedentes familiares no fue de interés genético.

La paciente nació por cesárea a las 40 semanas de gestación, con un APGAR de 8-9; talla 47 cm, perímetro cefálico 32 cm y peso 2940 gr. Presentó adecuada succión, tolerancia gástrica y llanto fuerte. Evidenció dismorfogénesis importante: frente plana, nariz puntiforme, implantación baja de las orejas, clinodactilia de la quinta falange, microcefalia, micrognatia y un orificio de 0.5 mm en la región lumbosacra), estatura baja y retardo mental leve. A los diez días se le evaluó por primera vez citogenéticamente, revelándose un anillo del cromosoma 4 en el 80% de las metafases analizadas y la línea normal de 46 cromosomas en el 20% restante. A los ocho meses de edad se le realizó una resonancia magnética contrastada de columna lumbar y se encontró un pequeño trayecto fistuloso que comunicaba la piel de la región sacra con la punta del coxis; no hubo presencia de lipoma, médula anclada, ni meningocele. A los dos años de edad se le realizó una tomografía simple y tridimensional de encéfalo, en donde no se evidenciaron anomalías.

A los diez años de edad acudió a consulta para control y se le realizó una segunda evaluación clínico-genética. Al examen físico presentaba estatura baja (talla de 125 cm) y un peso de 35 kg; conservaba una dismorfogénesis importante (frente plana, nariz puntiforme, implantación baja de las orejas, clinodactilia de la quinta falange, microcefalia, micrognatia y un orificio de 0.5 mm en la región lumbosacra), presentando retardo en el desarrollo y adicionalmente, como dato de interés, una personalidad muy agradable; (Foto 1) Con la finalidad de efectuar un análisis clínico comparativo, el fenotipo de la paciente fue cotejado con los hallazgos descritos en 37 casos reportados en la literatura internacional [8 – 44]. Se determinaron las diferentes características clínicas identificadas en los casos (incluyendo las de la paciente en estudio) y se calculó el porcentaje de presentación de cada una.

Foto1 (primer imagen a la derecha). Paciente de estudio. Izquierda: Paciente a los diez días de edad. En la imagen inferior se observa el orificio en la región lumbosacra. Centro y Derecha: Paciente en la actualidad (diez años de edad), vista frontal y lateral, en donde se observa microcefalia, frente aplanada, implantación baja de las orejas, nariz puntiforme y micrognatia. [Imágenes utilizadas bajo consentimiento informado de los representantes legales].

Estudio citogenético

Se estudió a la paciente y a sus progenitores con la metodología probada en trabajos anteriores [44]. Para la citogenética convencional se tomó muestra de sangre periférica con heparina y se cultivó 72 horas en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino 15%; los linfocitos fueron estimulados con fitohemaglutinina. Se realizó la cosecha con la técnica estándar de colchicina y fijador de carnoy; se extendió en un portaobjetos y se realizó bandeo GTG (Giemsa-Tripsina- Giemsa). Adicionalmente se realizaron cultivos para estudios citogenéticos a los padres de la paciente; se contabilizaron 100 metafases por individuo.

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

Se aplicó FISH a la paciente para corroborar los resultados obtenidos por citogenética y se emplearon sondas para evaluar el estado de la región 4p16.3 (Chr4: 492870-793359) y 4q35.2 (Chr4: 190183811-190408149) y como control el centrómero del cromosoma 4 (Chr4: 48461959-49066696) según el protocolo de origen (Agilent, Estados Unidos).

Array de mapeo genético

Para el análisis de arrays en la paciente, se utilizó 750 ng de ADN para la hibridación en el array Affymetrix 750K siguiendo las instrucciones del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los arrays se procesaron en la estación de fluidos Affymetrix 450 y fueron escaneados utilizando el escáner GeneChip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Resultados

Análisis clínico comparativo

En la revisión de las manifestaciones clínicas de los 37 casos reportados en la literatura y de la paciente estudiada, se encontró alrededor de 41 características clínicas diferentes, presentes de forma variada en cada sujeto.

El 78% de los casos presentaron retraso en el crecimiento, el 67% microcefalia, 62% retardo mental, 48% peso bajo al nacer, 37% clinodactilia del quinto dedo, 29% micrognatia, 21% hipertelorismo; y el 18% alguna cardiopatía como: falla cardiaca al nacimiento, comunicación intraventricular o interauricular, dextrocardia, transposición de grandes vasos. Adicionalmente los pacientes tuvieron malformación del pabellón auricular, como deformidad en forma de murciélago, orejas largas, hélices y lóbulos hipoplásicos. El 16% mostró criptorquidia (en pacientes masculinos), epicanto bilateral, implantación baja de las orejas y alguna malformación de los pliegues palmares, como pliegue palmar transverso o pliegue palmar único. El 13% presentaron paladar ojival, paladar hendido, nariz plana, convulsiones, edad ósea retrasada, un pequeño orificio en la región sacro-coxígea y falla renal al nacimiento. En el 10% hubo fisura labial, nariz puntiforme, hipospadias, falanges cortas y cambios en el tono de la piel como lesiones hipopigmentadas de bordes irregulares en el séptimo y décimo dermatoma, patrón de hiperpigmentación e hipopigmentación en la frente, y lentigo solar. En el 8% de los casos se encontró diferentes características clínicas como manchas café con leche, exoftalmia, coloboma, ptosis palpebral, dislocación de la cadera. El 5% de los casos tuvieron sobreposición de los dedos de los pies, cuello corto y cara redonda; y en el 2% de los casos se encontró genu valgum, microstomía, cifoescoliosis, ectrodactilia, agenesia bilateral radial, separación entre el primero y segundo ortejo y alteraciones en los dientes como falta de esmalte y caninos puntiagudos; tabla 1.

Tabla I. Comparación de las características clínicas de todos los casos reportados con cromosoma 4 en anillo.