Revista Bioreview Edición 109 - Septiembre 2020

BIODIAGNOSTICO

 

Caracterización molecular de Beta-lactamasas de espectro extendido en cepas de Escherichia coli causantes de infección urinaria en pacientes inmunocomprometidos.

Pereyra Marcia1, Ruiz Rosario2, Baez John3, Valenzuela Nicomedes3, Araya Jorge4, Silva Juan5, Cartagena Reynaldo6

1Médico Cirujano, Magister en Ciencias Biomédicas. Departamento de Tecnología Médica, Universidad de Antofagasta-Chile.
2Médico especialista en Medicina Interna y Dietética Clínica. Hospital Materno Infantil, Caja Nacional de Salud. La Paz-Bolivia.
3Tecnólogo Médico, Magister en Ciencias Biomédicas. Departamento de Tecnología Médica, Universidad de Antofagasta-Chile.
4Tecnólogo Médico, Doctor en Ciencias, Doctor en Microbiología Molecular. Departamento de Tecnología Médica, Universidad de Antofagasta-Chile.
5Tecnólogo Médico, Ph. D. Microbiología. Departamento de Tecnología Médica, Universidad de Antofagasta-Chile.
6Bioquímico. Post grado en Bacteriología. Laboratorios Ciencia y Medicina. La Paz-Bolivia

Trabajo realizado con muestras urinarias obtenidas de los departamentos de Hematología, Oncología, Neurología y Unidad de Terapia Intensiva
de Adultos del Hospital Materno Infantil y de la Caja Nacional de Salud, y procesadas en los laboratorios de Ciencia y Medicina en La Paz-Bolivia
y Departamento de Tecnología Médica de la Universidad de Antofagasta-Chile.

Correspondencia: Rosario Ruiz Domínguez, Teléfonos: 72557017 - 2228290 - Email: romarudo@yahoo.es
Revista Médica La Paz, versión On-line ISSN 1726-8958 - Rev. Méd. La Paz vol.25 no.2 La Paz 2019

Resumen 

Introducción. La Infección del Tracto Urinario (ITU) es la infección bacteriana que más se diagnostica en el mundo y su agente causal más frecuente es Escherichia coli (E. coli), bacteria que ha adquirido importancia por su capacidad de producir betalactamasa de espectro extendido (BLEE), lo cual dificulta su tratamiento y hace más frecuentes las infecciones recurrentes y recidivantes incluyendo sus complicaciones, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos. 

Objetivo. Identificar pacientes con ITU producidas por E. coli productoras de BLEE y evaluar su espectro antibacteriano y molecular. 

Material y métodos. Estudio longitudinal y prospectivo realizado con muestras urinarias de 53 pacientes de la Caja Nacional de Salud en La Paz-Bolivia. Se aisló como agente causal a E. coli en el 72% de las muestras, de estas, 35 presentaron fenotipo BLEE sensibles a imipenem, gentamicina y nitrofurantoina (100%) y amikacina (94%). Los ensayos de fenotipificación reportaron predominio del tipo PhP-2 y los filogenéticos (PCR y secuenciación) identificaron predominio de bla CTX-M-15 asociada a bla TEM-1. 

Conclusión. Los fármacos de primera línea para el tratamiento de la ITU no son adecuados, haciendo a los pacientes más susceptibles a infecciones recurrentes y recidivantes. Se deben identificar precozmente y tratar eficazmente las ITU producidas por cepas de E. coli productoras de BLEE. 

Palabras clave: Infección del tracto urinario, Escherichia coli productora de BLEE, Caracterización molecular y antibacteriana. 

Abstract  

Introduction. Urinary tract infection (UTI) is the most common diagnosed bacterial infection in the world and its most frequent causal agent is the Escherichia coli (E. coli), a bacterium that has gained importance due to its ability to produce extended-spectrum beta-lactamase (ESBL), which makes treatment difficult and leads to more frequent recurrent infections including their complications, and even more in immunocompromised patients. 

Objective. To identify patients with UTI caused by ESBL-producing E. coli and evaluate their antibacterial and molecular spectrum. 

Material and methods. A longitudinal and prospective study performed with urinary samples from 53 patients of Caja Nacional de Salud in La Paz, Bolivia. In 72% of the samples, E. coli was isolated as a causative agent, of these, 35 had ESBL phenotype, sensitive to imipenem, gentamicin and nitrofurantoin (100%) and amikacin (94%). Phenotyping assays reported a predominance of PhP-2 type and phylogenetic assays (PCR and sequencing) identified a predominance of bla CTX-M-15 associated with bla TEM-1. 

Conclusion. Early recognition and effective treatment of UTI produced by multiresistant ESBL-producing strains of E. coli should be recognized based on the evidence obtained. 

Key words: Urinary tract infection, ESBL-producing Escherichia coli, Molecular and antibacterial characterization. 

Introducción 

La infección del tracto urinario (ITU) es la infección bacteriana que más frecuentemente se diagnostica en el mundo; es común en mujeres jóvenes sexualmente activas, pero también está presente en pacientes mayores de ambos sexos (1-4). Escherichia Coli (E. Coli) es el agente causal del 90% de estas infecciones y son menos frecuentes Klebsiella, Proteus mirabilis y Staphylococcus saprophyticus (5-12). No es una enfermedad de notificación obligatoria, por lo cual su incidencia es desconocida en nuestro país. 

El tratamiento de la ITU se ha hecho complejo debido a que la prevalencia de uropatógenos multiresistentes se ha incrementado tanto en las infecciones adquiridas como en las nosocomiales (13-18), más si refiere a pacientes con comorbilidades o situaciones debilitantes que ocasionan  inmunodeficiencia(19). 

Actualmente, el estudio de los mecanismos de resistencia que presentan las bacterias a los antibióticos ha adquirido gran importancia; entre estos mecanismos, se destaca la producción de β-lactamasas, enzimas que inactivan a los antibióticos betalactámicos por hidrolización(18,19-26); y más aún, existe gran preocupación por las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) que han sido descritas en cepas de Escherichia coli y  Klebsiella sp(17-25, 27-32) 

La infección urinaria producida por E. coli productora de BLEE constituye una entidad clínica grave, que al igual que otras infecciones causadas por microorganismos multirresistentes a los antibióticos(30-42), supone una complicación en el momento de instaurar un tratamiento antibiótico correcto tanto para evitar recidivas y recurrencias de la infección(19,26-29,39-44) como para evitar las complicaciones y la diseminación de las bacterias productoras de BLEE(40,44,45-55) 

El presente estudio se realizó con el objetivo de identificar pacientes inmunocomprometidos con ITU producidas por E. coli productoras de BLEE y evaluar el espectro antibacteriano y molecular de estas, para tratar de forma efectiva las infecciones recurrentes y recidivantes en pacientes de la ciudad de La Paz-Bolivia. 

Material y Métodos

Se llevó a cabo un estudio longitudinal y prospectivo realizado con muestras urinarias de 53 pacientes con ITU atendidos entre enero y diciembre del año 2016. 

Se tomó datos de las historias clínicas que fueron transcritos a una base de datos en Excel. Se obtuvo muestras de orina de 53 pacientes, en condiciones asépticas por método del chorro medio. Las muestras fueron homogeneizadas y sembradas en placas con agar Mac Conkey; para su aislamiento, se seleccionaron las colonias lactosa positiva y se inocularon en tubos preparados con pruebas bioquímicas estandarizadas: Indol, Triple Sugar Iron (TSI), Lysine Iron Agar (LIA), citrato de Simmons, producción de ureasa y Movilidad Indol Ornitina (MIO) para su identificación como E. coli. 

Para determinar la susceptibilidad a los antibióticos, se realizó la técnica de difusión por discos, siguiendo los lineamientos de Clinical and  Laboratory Standard Institute (CLSI). Los antibióticos que se utilizaron fueron: ácido nalidíxico [30μg], amikacina [30μg], ampicilina [10μg], ampicilina-sulbactam [10/10μg], aztreonam [30μg], cefotaxima [30μg], ceftazidima [30μg], cefadroxilo [30μg], cefuroxima [30μg], ciprofloxacino [5μg], cloranfenicol [30μg], gentamicina [10μg], gentamicina de alta carga [120μg], kanamicina [30μg], imipenem [10μg], nitrofurantoina [300ug],  norfloxacino [10μg], piperacilina [100μg], piperacilina/ tazobactam [100/10μg], tetraciclina [30μg], trimetoprim/sulfametoxazol [25μg] (Oxoid,  Basingstoke, UK). 

La presencia fenotípica de BLEE en las cepas de E. coli se estudió por la técnica del doble disco de la CLSI. En estos ensayos, se utilizó como control BLEE negativo la cepa de E. coli ATCC 25922 y como control BLEE positivo la cepa de K. pneumoniae ATCC 700603. 

La identificación de los genes blaBLEE se realizó por técnica de PCR y secuenciación. 

La identificación de los fenotipos bioquímicos (biochemical fingerprinting) se realizó por la técnica de Phene Plate™ (PhP). 

La caracterización de los genotipos prevalentes de las cepas de E. coli productoras de BLEE se realizó mediante la técnica de electroforesis de campo pulsado (PFGE), utilizando un equipo CHEF-DRIII (BioRad). 

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statgraphics Centurion XVI, Versión 16.1.15 versión 3.02, Stat Point Technologies, Inc, Warrenton, Virginia. 

Resultados

Durante el período de estudio, se incluyó un total de 53 pacientes ingresados al hospital, con diferentes comorbilidades (Cuadro N° 1). 

Se identificó E. coli como agente etiológico de ITU en el 72% de los casos (Figura N°1).

De todas las cepas de E. coli aisladas, 35 cepas presentaron fenotipo BLEE con altos niveles de resistencia a CTX (97%) y a CAZ (66%); cepas altamente sensibles a imipenem y gentamicina (100%), Amikacina (94%), nitrofurantoina (80%), y a cloranfenicol (63%). 

Los ensayos de fenotipificación reportaron 12 fenotipos diferentes con predominio del tipo PhP-2 (31,6%), PhP-1 (15,8%), ambos con una divergencia menor 1%, sugerente de un mismo clon de infección intra-hospitalaria (IIH) y los PhP-S (47,4%) indican clones de circulación en la comunidad. 

Ref: Ampicilina AMP, ampicilina/ác. clavulánico SAM, piperacilina/tazobactam TZP, Cefadroxilo CPH, cefoxima CXM, cefotaxima CTX, ceftazidima CAZ, imipenem IMP, aztreonam AZ.

Los análisis moleculares con PCR y secuenciación permitieron identificar la presencia de blaCTX-M-15 (74,3%), blaTX-M-79(6,1%), blaCTX-M-28, blaCTX-M-55 (2,6%) y blaTEM-1(17%). 

El análisis filogenético mostro que los genes caracterizados son similares y se encuentran agrupados en el 99% de 500 repeticiones en el Cluter del grupo CTX-M-1; por lo tanto, los genes caracterizados contienen sitios de aminoácidos conservados para la BLEE de tipo CTX-M-1. 

Discusión 

En nuestro estudio, encontramos cepas de E. coli multirresistentes y productoras de BLEE en el 72% de los casos; este evento, puede haberse producido por el uso excesivo de antibióticos, lo cual habría favorecido la supervivencia de las cepas productoras de BLEE más adaptadas, en un ejemplo del modelo darwiniano como sugieren algunos autores(9,23,48,54). Sin embargo, otros estudios sugieren que otro de los factores de mayor riesgo para adquirir la infección por cepas BLEE, lo constituyen los pacientes que presentan otras enfermedades subyacentes e inmunodebilitantes (9, 19), principalmente neoplasias(19, 47), asociados a las múltiples y frecuentes terapias antibióticas recibidas durante sus internaciones. 

Se identificó molecularmente el gen que transcribía la producción de BLEE, en el 100% de las cepas de E. coli era blaCTX-M específicamente el gen blaCTX-M-15, que trascribe la BLEE tipo CTX-M-15, la enzima de mayor prevalencia actualmente con una gran distribución a nivel mundial. En Bolivia, se describió en el 2007 en muestras de heces de niños sanos(46). 

La caracterización molecular también permitió determinar que dos cepas además de presentar el gen de blaCTX-M-15, tienen asociadas otro gen BLEE de importancia clínica blaTEM-1 en el 25% de los casos, estos están aumentando en el mundo y se asocian con multirresistencia e infecciones más graves (51). 

Los resultados de este estudio determinan que los fármacos registrados como de primera línea para el tratamiento de la ITU no son adecuados, haciendo a los pacientes más susceptibles a infecciones recurrentes y recidivantes, además de complicaciones graves como urosepsis y shock, lo cual en un futuro obliga a iniciar terapias mucho más agresivas, haciendo a los carbapenémicos y aminoglucósidos terapias de primera línea. 

Es indispensable comprender la gravedad que implican nuestras conclusiones, se debe identificar precozmente y tratar eficazmente las ITU producidas por cepas bacterianas productoras de BLEE multirresistentes en pacientes inmuno y no inmunocomprometidos, y se debe vigilar de forma sistemática y prospectiva las unidades hospitalarias que se encargan del tratamiento de infecciones en pacientes inmunocomprometidos, esto para identificar y estudiar los pacientes infectados por estas bacterias y evitar su propagación dentro de nosocomios y en la comunidad. Consideramos que nuestros resultados pueden proporcionar información útil para fines clínicos tanto en nuestra institución como en otros centros nacionales y del exterior. 

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Resumen 

Introducción. La Infección del Tracto Urinario (ITU) es la infección bacteriana que más se diagnostica en el mundo y su agente causal más frecuente es Escherichia coli (E. coli), bacteria que ha adquirido importancia por su capacidad de producir betalactamasa de espectro extendido (BLEE), lo cual dificulta su tratamiento y hace más frecuentes las infecciones recurrentes y recidivantes incluyendo sus complicaciones, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos. 

Objetivo. Identificar pacientes con ITU producidas por E. coli productoras de BLEE y evaluar su espectro antibacteriano y molecular. 

Material y métodos. Estudio longitudinal y prospectivo realizado con muestras urinarias de 53 pacientes de la Caja Nacional de Salud en La Paz-Bolivia. Se aisló como agente causal a E. coli en el 72% de las muestras, de estas, 35 presentaron fenotipo BLEE sensibles a imipenem, gentamicina y nitrofurantoina (100%) y amikacina (94%). Los ensayos de fenotipificación reportaron predominio del tipo PhP-2 y los filogenéticos (PCR y secuenciación) identificaron predominio de bla CTX-M-15 asociada a bla TEM-1. 

Conclusión. Los fármacos de primera línea para el tratamiento de la ITU no son adecuados, haciendo a los pacientes más susceptibles a infecciones recurrentes y recidivantes. Se deben identificar precozmente y tratar eficazmente las ITU producidas por cepas de E. coli productoras de BLEE. 

Palabras clave: Infección del tracto urinario, Escherichia coli productora de BLEE, Caracterización molecular y antibacteriana. 

Abstract  

Introduction. Urinary tract infection (UTI) is the most common diagnosed bacterial infection in the world and its most frequent causal agent is the Escherichia coli (E. coli), a bacterium that has gained importance due to its ability to produce extended-spectrum beta-lactamase (ESBL), which makes treatment difficult and leads to more frequent recurrent infections including their complications, and even more in immunocompromised patients. 

Objective. To identify patients with UTI caused by ESBL-producing E. coli and evaluate their antibacterial and molecular spectrum. 

Material and methods. A longitudinal and prospective study performed with urinary samples from 53 patients of Caja Nacional de Salud in La Paz, Bolivia. In 72% of the samples, E. coli was isolated as a causative agent, of these, 35 had ESBL phenotype, sensitive to imipenem, gentamicin and nitrofurantoin (100%) and amikacin (94%). Phenotyping assays reported a predominance of PhP-2 type and phylogenetic assays (PCR and sequencing) identified a predominance of bla CTX-M-15 associated with bla TEM-1. 

Conclusion. Early recognition and effective treatment of UTI produced by multiresistant ESBL-producing strains of E. coli should be recognized based on the evidence obtained. 

Key words: Urinary tract infection, ESBL-producing Escherichia coli, Molecular and antibacterial characterization. 

Introducción 

La infección del tracto urinario (ITU) es la infección bacteriana que más frecuentemente se diagnostica en el mundo; es común en mujeres jóvenes sexualmente activas, pero también está presente en pacientes mayores de ambos sexos (1-4). Escherichia Coli (E. Coli) es el agente causal del 90% de estas infecciones y son menos frecuentes Klebsiella, Proteus mirabilis y Staphylococcus saprophyticus (5-12). No es una enfermedad de notificación obligatoria, por lo cual su incidencia es desconocida en nuestro país. 

El tratamiento de la ITU se ha hecho complejo debido a que la prevalencia de uropatógenos multiresistentes se ha incrementado tanto en las infecciones adquiridas como en las nosocomiales (13-18), más si refiere a pacientes con comorbilidades o situaciones debilitantes que ocasionan  inmunodeficiencia(19). 

Actualmente, el estudio de los mecanismos de resistencia que presentan las bacterias a los antibióticos ha adquirido gran importancia; entre estos mecanismos, se destaca la producción de β-lactamasas, enzimas que inactivan a los antibióticos betalactámicos por hidrolización(18,19-26); y más aún, existe gran preocupación por las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) que han sido descritas en cepas de Escherichia coli y  Klebsiella sp(17-25, 27-32) 

La infección urinaria producida por E. coli productora de BLEE constituye una entidad clínica grave, que al igual que otras infecciones causadas por microorganismos multirresistentes a los antibióticos(30-42), supone una complicación en el momento de instaurar un tratamiento antibiótico correcto tanto para evitar recidivas y recurrencias de la infección(19,26-29,39-44) como para evitar las complicaciones y la diseminación de las bacterias productoras de BLEE(40,44,45-55) 

El presente estudio se realizó con el objetivo de identificar pacientes inmunocomprometidos con ITU producidas por E. coli productoras de BLEE y evaluar el espectro antibacteriano y molecular de estas, para tratar de forma efectiva las infecciones recurrentes y recidivantes en pacientes de la ciudad de La Paz-Bolivia. 

Material y Métodos

Se llevó a cabo un estudio longitudinal y prospectivo realizado con muestras urinarias de 53 pacientes con ITU atendidos entre enero y diciembre del año 2016. 

Se tomó datos de las historias clínicas que fueron transcritos a una base de datos en Excel. Se obtuvo muestras de orina de 53 pacientes, en condiciones asépticas por método del chorro medio. Las muestras fueron homogeneizadas y sembradas en placas con agar Mac Conkey; para su aislamiento, se seleccionaron las colonias lactosa positiva y se inocularon en tubos preparados con pruebas bioquímicas estandarizadas: Indol, Triple Sugar Iron (TSI), Lysine Iron Agar (LIA), citrato de Simmons, producción de ureasa y Movilidad Indol Ornitina (MIO) para su identificación como E. coli. 

Para determinar la susceptibilidad a los antibióticos, se realizó la técnica de difusión por discos, siguiendo los lineamientos de Clinical and  Laboratory Standard Institute (CLSI). Los antibióticos que se utilizaron fueron: ácido nalidíxico [30μg], amikacina [30μg], ampicilina [10μg], ampicilina-sulbactam [10/10μg], aztreonam [30μg], cefotaxima [30μg], ceftazidima [30μg], cefadroxilo [30μg], cefuroxima [30μg], ciprofloxacino [5μg], cloranfenicol [30μg], gentamicina [10μg], gentamicina de alta carga [120μg], kanamicina [30μg], imipenem [10μg], nitrofurantoina [300ug],  norfloxacino [10μg], piperacilina [100μg], piperacilina/ tazobactam [100/10μg], tetraciclina [30μg], trimetoprim/sulfametoxazol [25μg] (Oxoid,  Basingstoke, UK). 

La presencia fenotípica de BLEE en las cepas de E. coli se estudió por la técnica del doble disco de la CLSI. En estos ensayos, se utilizó como control BLEE negativo la cepa de E. coli ATCC 25922 y como control BLEE positivo la cepa de K. pneumoniae ATCC 700603. 

La identificación de los genes blaBLEE se realizó por técnica de PCR y secuenciación. 

La identificación de los fenotipos bioquímicos (biochemical fingerprinting) se realizó por la técnica de Phene Plate™ (PhP). 

La caracterización de los genotipos prevalentes de las cepas de E. coli productoras de BLEE se realizó mediante la técnica de electroforesis de campo pulsado (PFGE), utilizando un equipo CHEF-DRIII (BioRad). 

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statgraphics Centurion XVI, Versión 16.1.15 versión 3.02, Stat Point Technologies, Inc, Warrenton, Virginia. 

Resultados

Durante el período de estudio, se incluyó un total de 53 pacientes ingresados al hospital, con diferentes comorbilidades (Cuadro N° 1). 

Se identificó E. coli como agente etiológico de ITU en el 72% de los casos (Figura N°1).

De todas las cepas de E. coli aisladas, 35 cepas presentaron fenotipo BLEE con altos niveles de resistencia a CTX (97%) y a CAZ (66%); cepas altamente sensibles a imipenem y gentamicina (100%), Amikacina (94%), nitrofurantoina (80%), y a cloranfenicol (63%). 

Los ensayos de fenotipificación reportaron 12 fenotipos diferentes con predominio del tipo PhP-2 (31,6%), PhP-1 (15,8%), ambos con una divergencia menor 1%, sugerente de un mismo clon de infección intra-hospitalaria (IIH) y los PhP-S (47,4%) indican clones de circulación en la comunidad. 

Ref: Ampicilina AMP, ampicilina/ác. clavulánico SAM, piperacilina/tazobactam TZP, Cefadroxilo CPH, cefoxima CXM, cefotaxima CTX, ceftazidima CAZ, imipenem IMP, aztreonam AZ.

Los análisis moleculares con PCR y secuenciación permitieron identificar la presencia de blaCTX-M-15 (74,3%), blaTX-M-79(6,1%), blaCTX-M-28, blaCTX-M-55 (2,6%) y blaTEM-1(17%). 

El análisis filogenético mostro que los genes caracterizados son similares y se encuentran agrupados en el 99% de 500 repeticiones en el Cluter del grupo CTX-M-1; por lo tanto, los genes caracterizados contienen sitios de aminoácidos conservados para la BLEE de tipo CTX-M-1. 

Discusión 

En nuestro estudio, encontramos cepas de E. coli multirresistentes y productoras de BLEE en el 72% de los casos; este evento, puede haberse producido por el uso excesivo de antibióticos, lo cual habría favorecido la supervivencia de las cepas productoras de BLEE más adaptadas, en un ejemplo del modelo darwiniano como sugieren algunos autores(9,23,48,54). Sin embargo, otros estudios sugieren que otro de los factores de mayor riesgo para adquirir la infección por cepas BLEE, lo constituyen los pacientes que presentan otras enfermedades subyacentes e inmunodebilitantes (9, 19), principalmente neoplasias(19, 47), asociados a las múltiples y frecuentes terapias antibióticas recibidas durante sus internaciones. 

Se identificó molecularmente el gen que transcribía la producción de BLEE, en el 100% de las cepas de E. coli era blaCTX-M específicamente el gen blaCTX-M-15, que trascribe la BLEE tipo CTX-M-15, la enzima de mayor prevalencia actualmente con una gran distribución a nivel mundial. En Bolivia, se describió en el 2007 en muestras de heces de niños sanos(46). 

La caracterización molecular también permitió determinar que dos cepas además de presentar el gen de blaCTX-M-15, tienen asociadas otro gen BLEE de importancia clínica blaTEM-1 en el 25% de los casos, estos están aumentando en el mundo y se asocian con multirresistencia e infecciones más graves (51). 

Los resultados de este estudio determinan que los fármacos registrados como de primera línea para el tratamiento de la ITU no son adecuados, haciendo a los pacientes más susceptibles a infecciones recurrentes y recidivantes, además de complicaciones graves como urosepsis y shock, lo cual en un futuro obliga a iniciar terapias mucho más agresivas, haciendo a los carbapenémicos y aminoglucósidos terapias de primera línea. 

Es indispensable comprender la gravedad que implican nuestras conclusiones, se debe identificar precozmente y tratar eficazmente las ITU producidas por cepas bacterianas productoras de BLEE multirresistentes en pacientes inmuno y no inmunocomprometidos, y se debe vigilar de forma sistemática y prospectiva las unidades hospitalarias que se encargan del tratamiento de infecciones en pacientes inmunocomprometidos, esto para identificar y estudiar los pacientes infectados por estas bacterias y evitar su propagación dentro de nosocomios y en la comunidad. Consideramos que nuestros resultados pueden proporcionar información útil para fines clínicos tanto en nuestra institución como en otros centros nacionales y del exterior. 

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