Revista Bioreview Edición 83 - Julio 2018

BIODIAGNOSTICO
LABORATORIO DE MEDICINA

 

Frecuencia de las mutaciones más comunes del gen CFTR en pacientes peruanos con fibrosis quística mediante la técnica ARMS-PCR

Ruth Aquino, Ana Protzel, Juan Rivera, Hugo Abarca, Milagros Dueñas, Cecilia Nestarez, Nestor Purizaga, Benoit Diringer 

 

Ruth Aquino 

Biólogo

Magister en Biotecnología Molecular

Universidad Nacional de Tumbes. Tumbes, Perú.

Empresa de Investigación y Capacitación en Biotecnología Inca’Biotec. Tumbes, Perú.

Ana Protzel 

Pediatra - Genetista

Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins. Lima, Perú.

Juan Rivera 

Pediatra

Gastroenterólogo

Instituto Nacional de Salud del Niño. Lima, Perú.

Hugo Abarca 

Médico genetista

Instituto Nacional de Salud del Niño. Lima, Perú.

Milagros Dueñas 

Médico genetista

Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins. Lima, Perú.

Cecilia Nestarez 

Obstetra

Asociación de Padres de Niños con Fibrosis Quística. Lima, Perú.

Nestor Purizaga 

Patólogo clínico

Universidad Nacional de Tumbes. Tumbes, Perú.

Benoit Diringer 

Magíster en Ciencias de la Vida y de la Tierra

Empresa de Investigación y Capacitación en Biotecnología Inca’Biotec. Tumbes, Perú.

Correspondencia: Ruth Aquino Ordinola Dirección: Laboratorio de Biotecnología Molecular, Universidad Nacional de Tumbes. Av. Universitaria s/n, Pampa Grande. Tumbes, Perú. Teléfono: (+51) 948359340 Correo electrónico: ruthaquinord@gmail.com 

Contribuciones de autoría: RAO, AP; JR, HA, MD, CN, NP, BD contribuyeron con la concepción del artículo, redacción del artículo y obtención del financiamiento. RAO, AP; JR, HA, MD, CN, NP contribuyeron con la recolección de los datos. RAO y BD realizaron el análisis de los datos. Todos aprobaron la versión final del manuscrito

Conflicto de intereses: los autores declaran no tener ningún conflicto de interés

Resumen

Objetivos. Determinar la frecuencia de las diez mutaciones más comúnmente reportadas en América Latina del gen CFTR mediante Sistema de Mutación Refractario a la amplificación por PCR (ARMS-PCR) en los pacientes con fibrosis quística (FQ) de dos instituciones hospitalarias de referencia en el Perú durante el año 2014. 

Materiales y métodos. Se evaluó la frecuencia de las diez más comúnmente reportadas del gen CFTR en los pacientes del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins y el Instituto Nacional de Salud del Niño, ambos ubicados en Lima, Perú. Se recogieron muestras de sangre de 36 pacientes con FQ y se utilizó la técnica de ARMS-PCR para determinar la presencia de tales mutaciones. 

Resultados. Se incluyó al 73,5% de los pacientes con diagnóstico conocido de FQ en el país al momento en que se realizó el estudio. El diagnóstico por ARMS-PCR permitió identificar las mutaciones en 30,6% de los alelos de los pacientes con FQ, el 64,9% de los alelos mutados no fue identificado. Las mutaciones encontradas fueron p.Phe508del (22,2%), p.Gly542* (6,9%) y p.Arg1162* (1,4%). 

Conclusiones. Existe una variabilidad significativa de las mutaciones presentes en nuestra población de estudio en comparación con lo reportado en otros países de Latinoamérica, tanto en la frecuencia como en el tipo. Es necesario realizar estudios que usen la tecnología de secuenciación completa del gen CFTR para identificar otras mutaciones presentes en nuestra población.

Palabras clave: Fibrosis quística; Mutación; Diagnóstico, Perú

Abstract

Objectives. To determine the frequency of the ten most common mutations of the CFTR gene reported in Latin Americausing amplification-refractory mutation system-polymerase chain reaction (ARMS-PCR) in patients with cystic fibrosis (CF) in two referral hospitals in Peru during the year 2014. 

Materials and Methods. The frequency of the ten most common mutations of the CFTR gene was assessed in patients of the Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins and the Instituto Nacional de Salud del Niño, both located in Lima, Peru. Blood samples were collected from 36 patients with CF, and the ARMS-PCR technique was used to determine the presence of these mutations. 

Results. The study group included 73.5% of patients with a known diagnosis of CF in the country when the study was carried out. ARMS-PCR allowed three of the mutations to be identified in a combined 30.6% of the alleles from patients with CF, and 64.9% of the mutated alleles were not identified. The mutations found were p.Phe508del (22,2%), p.Gly542* (6,9%), and p.Arg1162* (1,4%). 

Conclusions. There is significant variability in both the frequency and type of mutations present in our study population and in what has been reported in other Latin American countries. It is necessary to perform studies that use complete sequencing technology for the CFTR gene to identify other mutations present in our population.

Keywords: Cystic Fibrosis; Mutation; Diagnosis, Peru

Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad congénita ocasionada por un gen autosómico recesivo que afecta a 1 de cada 3500 nacidos vivos a nivel mundial y cuya prevalencia es mayor entre poblaciones caucásicas1. Las mutaciones que inducen la FQ han sido asociadas a defectos de una proteína reguladora del transporte de cloro codificada por el gen CFTR (en inglés: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)2. Las mutaciones en el CFTR causan un defecto en el transporte de agua dentro y fuera de las células, lo que resulta en exceso de secreción de moco anormalmente espeso y viscoso a nivel pulmonar, pancreático, e intestinal, y conlleva a complicaciones graves e incluso la muerte1. A la fecha, más de 1900 mutaciones diferentes han sido identificadas en el gen CFTR, sin embargo, la deleción del codón para la fenilalanina en la posición 508 (p.Phe508del) es la más frecuente1. Los orígenes de las mutaciones del CFTR son específicos a ciertas zonas geográficas; algunas pueden ser restringidas a ciertos países, regiones e incluso familias3. Las mutaciones encontradas entre los diferentes países de Latinoamérica reflejan la gran heterogeneidad genética de sus habitantes4 y son probablemente heredadas de los flujos migratorios que ocurrieron en los últimos siglos5. La población peruana es el producto del mestizaje entre amerindios, españoles, africanos y asiáticos; por lo que se espera que existan variaciones importantes dentro del país y de una región a otra en relación al componente étnico que predomine en cada zona.

El tipo de mutaciones presente en ambos alelos del gen CFTR influye en la severidad del disfuncionamiento del canal de transporte del CFTR. Dicha variabilidad conduce a un cuadro clínico de expresión variable, por lo que la tipificación del perfil genético de cada paciente es fundamental para elegir las opciones terapéuticas, establecer el pronóstico y brindar la asesoría genética.

En Latinoamérica, el subdiagnóstico de FQ ocurre a causa de la falta de sospecha clínica y/o elementos adecuados para el diagnóstico6. En el Perú, la FQ es una enfermedad infradiagnosticada y con limitaciones de acceso a exámenes de diagnóstico como la prueba de sudor y estudios moleculares; así como el tamizaje neonatal con la prueba de tripsina inmunoreactiva (IRT) que se realiza sistemáticamente en países del hemisferio norte7. Además, no existen estudios de prevalencia ni de caracterización genética de la enfermedad. No obstante, según los datos estadísticos existentes para América Latina, en el Perú estarían naciendo de 60 a 120 niños con FQ cada año7. Actualmente, en los países desarrollados, los individuos diagnosticados con FQ son sometidos a tratamientos terapéuticos avanzados que les permiten tener una esperanza de vida de 39 años8. En el Perú se conoce menos de 50 pacientes vivos con diagnóstico confirmado, y la gran mayoría son pacientes en edad pediátrica9. Este estudio tiene por objetivo evaluar la frecuencia de diez de las mutaciones más comunes en América Latina7, mediante el Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR (ARMS-PCR, por sus siglas en inglés) en los pacientes con FQ en el Perú.

Los resultados obtenidos en esta investigación son los primeros publicados en el país considerando un número significativo de pacientes.

Materiales y Métodos

DISEÑO Y POBLACIÓN DE ESTUDIO

Se realizó un estudio observacional transversal de tipo descriptivo. La población estuvo compuesta por pacientes con FQ registrados en los dos hospitales especializados de Lima que atienden a la mayoría de pacientes con FQ, el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins (HNERM), perteneciente al Seguro Social del Perú y el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN), del Ministerio de Salud; invitados a través de la Asociación Peruana de FQ (FIQUI-Perú). Los pacientes habían sido previamente diagnosticados mediante la prueba de sudor y no contaban con diagnóstico molecular. El estudio se realizó durante el año 2014. El muestreo fue por conveniencia debido a la baja prevalencia de la enfermedad.

CRITERIOS DE SELECCIÓN

Los criterios de inclusión fueron: haber sido atendido en las dos instituciones previamente detalladas (HNERM y INSN) durante el año 2014 y tener el diagnóstico de FQ con dos pruebas positivas de sudor de sudor (> 60 mEq/L). Se excluyeron aquellos pacientes que no desearon participar en el estudio o se negaban a firmar el consentimiento informado.

ANÁLISIS MOLECULAR

Se recogió una muestra de sangre periférica de cada paciente; posteriormente, las muestras fueron enviadas al Laboratorio de Biotecnología molecular de la Empresa de Investigación y Capacitación en Biotecnología Inca’Biotec/Universidad Nacional de Tumbes. A cada muestra se les realizó una extracción de ADN de las células blancas de la sangre, de acuerdo a protocolos ya probados10. La calidad y concentración del ADN obtenido fue evaluada mediante espectrofotometría de luz ultravioleta con el biofotómetro (Eppendorf(r)).

El ADN aislado de cada paciente fue amplificado con la técnica de Reacción en cadena polimerasa de sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS-PCR) para identificar las diez mutaciones más comunes: p.Phe508del, c.489+1G>T, p.Gly551Asp, p.Asn1303Lys, p.Gly542*, p.Lys1177Serfs*15, c.1585-1G>A, p.Trp1282*, p.Arg553*, p.Arg1162*, usando el kit de ADN Platinum(r) de Invitrogen, a partir de protocolos modificados de las referencias (11, 12).

Para las mutaciones p.Phe508del, c.489+1G>T, p.Asn1303Lys, p.Gly551Asp y p.Gly542*, se desarrollaron cuatro mezclas. En cada una de las mezclas se incluyeron 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR y 1 U/µL de taq ADN polimerasa. Adicionalmente, en la primera mezcla se agregaron cebadores para: p.Phe508del (normal: 1,5 μM; común: 0,5 μM), c.489+1G>T (normal: 0,5 μM, común: 0,5), p.Asn1303Lys (normal: 2 μM; común: 2 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Phe508del (mutado: 2 μM; común: 2 μM), c.489+1G>T (mutado: 0,25 μM; común: 0,25 μM), p.Asn1303Lys (mutado: 1 μM; común: 1 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la tercera mezcla cebadores para: p.Gly551Asp (mutado: 0,5 μM; común: 0,5 μM), p.Gly542* (mutado: 0,5 μM) y 100 ng/μL de ADN; y en la cuarta mezcla cebadores para: G551D (normal: 0,25 μM; común: 0,5 μM), G542X (normal: 0,25 μM) y 100 ng/μL de ADN. Las cuatro mezclas tuvieron un volumen final de 20 μL cada una. La amplificación se realizó en un termociclador (Biometra - USA), las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 61°C durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para las mutaciones p.Lys1177Serfs*15, c.1585-1G>A se realizaron dos mezclas. Ambas incluyeron 200 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR y 1 U/μL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Adicionalmente, en la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Lys1177Serfs*15 (normal: 2 μM; común: 2 μM), c.1585-1G>A (mutado: 1,5 μM; común: 1,5 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Lys1177Serfs*15 (mutado: 1,5 μM de; común: 1,5 μM), c.1585-1G>A (normal: 0,5 μM; común: 1,5 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue 20 μL. Las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94°C durante 2 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 65 °C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para el diagnóstico de la mutación p.Arg1162*, se prepararon dos mezclas. Ambas contenían 200 μM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR, 1,25 U/μL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Adicionalmente, en la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Arg1162* (común: 10 μM; normal: 10 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Arg1162* (común: 10 μM; mutado: 10 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue de 20 µL. Las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 95 °C durante 1 min, hibridación durante 30 s (a 63 °C para la primera mezcla y a 60 °C para la segunda mezcla), y extensión a 72 °C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para la mutación p.Arg553*, se realizó el protocolo de Single ARMS-PCR en dos mezclas. Ambas contenían 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer de PCR, 1 U/µL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Además, en la primera mezcla se agregaron cebadores para: p.Arg553* (común: 0,86 μM; normal: 0,86 μM), AAT1 (0,86 μM), AAT2 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Arg553* (común: 0,86 μM; mutado: 0,86 μM), AAT1 (0,86 μM), AAT2 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue de 20 µL. Las condiciones térmicas de amplificación para ambas mezclas fueron desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 2 min, hibridación a 60 °C durante 2 min, y extensión a 72 °C durante 2 min, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

También se desarrolló el protocolo de Single ARMS-PCR para la mutación p.Trp1282*, este se realizó en dos mezclas. Ambas contenían 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR, 1 U/µL de taq ADN polimerasa Platinum(r). En la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Trp1282* (común: 0,86 μM; normal: 0,86 μM), AAT3 (0,86 μM), AAT4 (0.86 μM) y 100 ng/μL de ADN; la segunda muestra cebadores para: p.Trp1282* (común: 0,86; mutado: 0,86 μM), AAT3 (0,86 μM), AAT4 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN. Ambas mezclas se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μL. Las condiciones térmicas de amplificación para ambas mezclas fueron desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 45 s, hibridación a 60°C durante 45 s, y extensión a 72 °C durante 45 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min. Las secuencias de los cebadores utilizados se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de cebadores.

Tabla 1. Secuencias de cebadores usados para la detección de mutaciones mediante la técnica ARMS-PCR.

Los productos de amplificación se separaron por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2% en una cámara electroforética (Cleaver scientific, Reino Unido) y se observaron en un transiluminador (Vilber lourmat, Francia). Los alelos normales y mutados fueron evidenciados por el número de pares de base (pb) y se compararon con controles positivos, obtenidos de Francia (p.Phe508del, p.Gly551Asp, p.Gly542*, p.Asn1303Lys); y controles internos AAT ALFA correspondientes al gen antitripsina13, estos permitieron validar el diagnóstico.

Los tamaños de los amplicones obtenidos fueron estimados gracias al uso de marcador de peso molecular (MPM) de 100 pb obtenidos de Promega.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos se analizaron utilizando estadística de tipo descriptiva. Los datos cualitativos fueron expresados como frecuencia y porcentaje.

ASPECTOS ÉTICOS

El presente estudio fue aprobado por los comités de ética del HNERM y el INSN. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de cada padre o apoderado de los niños considerados en este estudio.

RESULTADOS

La búsqueda de casos para incluirlos en nuestro estudio nos permitió identificar al total de pacientes con FQ con atención médica en el Perú en el momento del estudio, los cuales fueron 49 pacientes. Algunos de estos ya tenían el diagnóstico genético que había sido realizado en laboratorios de fuera del país (Estados Unidos, Chile y Francia).

El presente estudio incluyó 36 pacientes peruanos con FQ. El rango de edad de los pacientes estuvo comprendido entre el primer año 8 meses y los 19 años de edad. La edad promedio fue de 8 años 6 meses. Diecinueve casos (52,8%) fueron varones. La procedencia de los pacientes correspondió a la ciudad de Lima con 26 casos (72,2%) seguida de Arequipa con 2 (5,6%), y otras ocho ciudades (Amazonas, Junín, Ancash, Cajamarca, Ica, Tacna, La Libertad y Loreto) que contribuyeron con un caso cada una (2,8%).

Quince de los 36 pacientes (41.6%) fueron positivos para al menos una de las diez mutaciones evaluadas. Asimismo, se detectaron tres (p.Phe508del, p.Gly542*, p.Arg1162*) de las diez mutaciones más frecuentes evaluadas. De los 72 alelos analizados, 22 fueron positivos (30,6%). La mutación p.Phe508del fue la más frecuente y se encontró en 16 de un total de 72 alelos (22,2%), la mutación p.Gly542* en cinco alelos (6,9%), y la mutación p.Arg1162* en un alelo (1,4%) (Tabla 2).

Tabla 2. Frecuencia alélica relativa de las mutaciones encontradas en los pacientes peruanos con FQ

Se identificaron mutaciones en ambos alelos en siete de 36 pacientes (19,5%) y al menos una mutación en ocho de 36 (22,2%) pacientes. No se encontraron mutaciones en 21 de 36 pacientes.

En el caso de frecuencia genotípica, el genotipo más frecuente fue el p.Phe508del/ND que estuvo presente en cinco de los 36 pacientes (13,9%), seguido del genotipo p.Phe508del/p.Phe508del con cuatro pacientes (11,1%) y p.Gly542*/ND con 3 pacientes (8,33%) (Tabla 3).

Tabla 3. Frecuencia genotípica relativa de las mutaciones encontradas en pacientes peruanos con fibrosis quística

Discusión

A pesar de que los pacientes eran de diez ciudades del Perú, la mayoría de estos provenían de la ciudad de Lima, lo que podría explicarse porque en esta ciudad se encuentran la mayoría de instituciones que tratan la FQ y por tanto las que con más frecuencia detectarían la enfermedad.

Dentro de las diez mutaciones estudiadas, nuestro estudio solo encontró tres (p.Phe508del, p.Gly542* y p.Arg1162*). Estos resultados contrastan con lo que se esperaba encontrar al considerar las mutaciones más frecuentes de la región de acuerdo a un estudio publicado previamente7; y nos indicaría que la población de nuestro país podría presentar mutaciones diferentes, quizá producto del mestizaje u otro factor no considerado.

La mutación p.Phe508del, la más representativa a nivel mundial2, fue también la más común en nuestro estudio (22.2%); sin embargo, al compararla con otros países, la frecuencia fue inferior al promedio latinoamericano (46,7%) o a países como Argentina (59,2%), Uruguay (56,6%), Brasil (43,1%), Chile (39,3%), Cuba (34,0%) y Ecuador (31,4%), aunque fue ligeramente superior a Costa Rica (22,9%)7.

La mutación p.Gly542* fue la segunda mutación más frecuente. Esta mutación se encuentra en el exón 11 del gen CFTR y pertenece a la clase de mutaciones I. Es la segunda más difundida en el mundo, se encuentra con una prevalencia más o menos constante y presenta una baja varianza entre poblaciones14. Su presencia en la población peruana se explicaría por la fuerte inmigración española que recibieron los países latinoamericanos.

En nuestro estudio, esta mutación tuvo una frecuencia (6,9%) más alta en comparación con Argentina (4,9%) o Ecuador (2%), similar a Brasil (5,3%) y Chile (5,6%), e inferior respecto a Uruguay (7,9%) o Costa Rica, país que presenta una frecuencia de 25%7. La mutación p.Arg1162* fue la tercera mutación hallada en nuestro estudio (un alelo; 1,4%) y su frecuencia fue mayor si se compara con países de Latinoamérica (0,01%); sin embargo, esta prevalencia podría ser sobreestimada debido al tamaño relativamente reducido de la población estudiada, además que esta mutación solo fue encontrada en un paciente heterocigoto (Tabla 3). La combinación de un alelo mutado de tipo p.Arg1162* con otro de tipo p.Phe508del conduce a varios síntomas severos que incluyen la afección hepática; p.Arg1162* es una mutación sin sentido, muy común en el noreste de Italia15. No pudimos detectar las mutaciones causantes de FQ en el 58,3% de los pacientes analizados. Esto se debió a que solo evaluamos las diez mutaciones más comunes en Latinoamérica y usamos un kit casero de ARMS-PCR. Es posible que los pacientes peruanos sean portadores de varias mutaciones y tengan una heterogeneidad genética alta tal como se ha mostrado en otros países latinoamericanos16.

Como dato adicional, se identificaron a once pacientes que ya tenían diagnóstico genético y cuyos resultados fueron colectados mediante encuestas directas realizadas por la asociación FIQUI Perú9. De esta población todos los pacientes mostraron ser heterocigotos compuestos, siendo la mutación p.Phe508del la más frecuente (31,8%; 7/22). Asimismo, en el mismo grupo se identificaron mutaciones raras como p.Arg1162*, p.Gln220*, p.Gly551Asp, p.Phe57Leu, c.1116+2T>C, c.2657+5G>A, p.Arg334Trp, p.Lys684Serfs*38, p.Arg347Pro y p.Lys1177Serfs*15, presentes como un alelo único. La mayor frecuencia del alelo p.Phe508del en comparación a nuestro estudio probablemente ocurra debido al pequeño tamaño de pacientes incluidos en este subgrupo y porque tres de estos pacientes eran hermanos, por lo tanto tenían las mismas mutaciones. Esta información no publicada en otra serie se suma a nuestros resultados, y ambos resaltan la heterogeneidad racial del país y confirmarían la hipótesis de que existen mutaciones poco comunes en nuestra población.

La identificación de las mutaciones presentes en los alelos del CFTR es de suma importancia para los pacientes, no solamente porque son confirmativas de la enfermedad sino también porque diferentes moléculas farmacéuticas han demostrado poder corregir completamente o atenuar los signos clínicos de la enfermedad, pero de forma específica a ciertas mutaciones (17, 18). Estos moduladores del CFTR incluyen potenciadores como el Ivacaftor VX-770 (nombre comercial: Kalydeco(r)) para pacientes con la mutación G551D, que incrementa el tráfico del cloruro por el canal del CFTR (mutaciones de clase III) 19; correctores como el Lumacaftor VX-809 para pacientes con mutación p.Phe508del en forma homocigota, que mejora el plegamiento y el tráfico de la proteína CFTR anormal (mutaciones clase II) y que actualmente es comercializado como Orkambi(r) (lumacaftor + ivacaftor)20; y otras moléculas como el Ataluren, el cual está siendo evaluado en ensayos clínicos (nivel III), que corregiría las mutaciones que generan la aparición de un codón stop prematuro como la p.Arg1162* (mutaciones de clase I)21, 22. Este estudio permitió resaltar que las frecuencias de las mutaciones evaluadas fueron relativamente bajas y que probablemente fueron adquiridas de descendientes europeos. Se requiere de otros estudios que permitan evaluar una mayor cantidad de mutaciones usando kits de ARMS-PCR que son comercialmente disponibles en otros países. No obstante, si analizamos las bajas coberturas que estos kits presentan para la población sudamericana, existe una clara necesidad de ampliar herramientas de secuenciamiento de ADN de próxima generación (en inglés: Next Generation Sequencing)23 para aumentar las tasas de detección. Por otra parte, las herramientas de secuenciación directa del CFTR y la búsqueda de reordenamientos genómicos permitirán detectar posibles mutaciones prevalentes a nivel regional y mutaciones raras (privados) que no se encuentran con las pruebas de mutaciones específicas propuestas por los kits de ARMS-PCR 24,25. Nuestro estudio servirá como base para el establecimiento de futuras iniciativas de prevención que permitan el tamizaje de las mutaciones más frecuentes en la población general con el fin de identificar a eventuales portadores (hermanos, primos, etc.), futuros esposos, o permitir la fertilización in vitro con selección de embriones sanos en el caso de parejas portadoras.

En conjunto, la implementación en el país de herramientas de diagnóstico molecular permitiría la confirmación del diagnóstico, garantizaría un asesoramiento genético adecuado y lograría que los pacientes portadores de ciertas mutaciones puedan acceder a tratamientos curativos o paliativos que mejoren su calidad de vida26. Para luchar contra la FQ de forma más eficaz y mejorar la esperanza de vida de los pacientes peruanos, el país debería implementar una estrategia de diagnóstico sistemático con pruebas de tamizaje neonatal por IRT y establecer laboratorios de diagnóstico confirmativo por pruebas de sudor y equipos de diagnóstico molecular capaces de realizar pruebas genéticas de escaneo del gen CFTR.

 

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Fuentes de financiamiento este trabajo fue financiado por los recursos del canon y sobrecanon entregados a la Universidad Nacional de Tumbes.

Resumen

Objetivos. Determinar la frecuencia de las diez mutaciones más comúnmente reportadas en América Latina del gen CFTR mediante Sistema de Mutación Refractario a la amplificación por PCR (ARMS-PCR) en los pacientes con fibrosis quística (FQ) de dos instituciones hospitalarias de referencia en el Perú durante el año 2014. 

Materiales y métodos. Se evaluó la frecuencia de las diez más comúnmente reportadas del gen CFTR en los pacientes del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins y el Instituto Nacional de Salud del Niño, ambos ubicados en Lima, Perú. Se recogieron muestras de sangre de 36 pacientes con FQ y se utilizó la técnica de ARMS-PCR para determinar la presencia de tales mutaciones. 

Resultados. Se incluyó al 73,5% de los pacientes con diagnóstico conocido de FQ en el país al momento en que se realizó el estudio. El diagnóstico por ARMS-PCR permitió identificar las mutaciones en 30,6% de los alelos de los pacientes con FQ, el 64,9% de los alelos mutados no fue identificado. Las mutaciones encontradas fueron p.Phe508del (22,2%), p.Gly542* (6,9%) y p.Arg1162* (1,4%). 

Conclusiones. Existe una variabilidad significativa de las mutaciones presentes en nuestra población de estudio en comparación con lo reportado en otros países de Latinoamérica, tanto en la frecuencia como en el tipo. Es necesario realizar estudios que usen la tecnología de secuenciación completa del gen CFTR para identificar otras mutaciones presentes en nuestra población.

Palabras clave: Fibrosis quística; Mutación; Diagnóstico, Perú

Abstract

Objectives. To determine the frequency of the ten most common mutations of the CFTR gene reported in Latin Americausing amplification-refractory mutation system-polymerase chain reaction (ARMS-PCR) in patients with cystic fibrosis (CF) in two referral hospitals in Peru during the year 2014. 

Materials and Methods. The frequency of the ten most common mutations of the CFTR gene was assessed in patients of the Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins and the Instituto Nacional de Salud del Niño, both located in Lima, Peru. Blood samples were collected from 36 patients with CF, and the ARMS-PCR technique was used to determine the presence of these mutations. 

Results. The study group included 73.5% of patients with a known diagnosis of CF in the country when the study was carried out. ARMS-PCR allowed three of the mutations to be identified in a combined 30.6% of the alleles from patients with CF, and 64.9% of the mutated alleles were not identified. The mutations found were p.Phe508del (22,2%), p.Gly542* (6,9%), and p.Arg1162* (1,4%). 

Conclusions. There is significant variability in both the frequency and type of mutations present in our study population and in what has been reported in other Latin American countries. It is necessary to perform studies that use complete sequencing technology for the CFTR gene to identify other mutations present in our population.

Keywords: Cystic Fibrosis; Mutation; Diagnosis, Peru

Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad congénita ocasionada por un gen autosómico recesivo que afecta a 1 de cada 3500 nacidos vivos a nivel mundial y cuya prevalencia es mayor entre poblaciones caucásicas1. Las mutaciones que inducen la FQ han sido asociadas a defectos de una proteína reguladora del transporte de cloro codificada por el gen CFTR (en inglés: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)2. Las mutaciones en el CFTR causan un defecto en el transporte de agua dentro y fuera de las células, lo que resulta en exceso de secreción de moco anormalmente espeso y viscoso a nivel pulmonar, pancreático, e intestinal, y conlleva a complicaciones graves e incluso la muerte1. A la fecha, más de 1900 mutaciones diferentes han sido identificadas en el gen CFTR, sin embargo, la deleción del codón para la fenilalanina en la posición 508 (p.Phe508del) es la más frecuente1. Los orígenes de las mutaciones del CFTR son específicos a ciertas zonas geográficas; algunas pueden ser restringidas a ciertos países, regiones e incluso familias3. Las mutaciones encontradas entre los diferentes países de Latinoamérica reflejan la gran heterogeneidad genética de sus habitantes4 y son probablemente heredadas de los flujos migratorios que ocurrieron en los últimos siglos5. La población peruana es el producto del mestizaje entre amerindios, españoles, africanos y asiáticos; por lo que se espera que existan variaciones importantes dentro del país y de una región a otra en relación al componente étnico que predomine en cada zona.

El tipo de mutaciones presente en ambos alelos del gen CFTR influye en la severidad del disfuncionamiento del canal de transporte del CFTR. Dicha variabilidad conduce a un cuadro clínico de expresión variable, por lo que la tipificación del perfil genético de cada paciente es fundamental para elegir las opciones terapéuticas, establecer el pronóstico y brindar la asesoría genética.

En Latinoamérica, el subdiagnóstico de FQ ocurre a causa de la falta de sospecha clínica y/o elementos adecuados para el diagnóstico6. En el Perú, la FQ es una enfermedad infradiagnosticada y con limitaciones de acceso a exámenes de diagnóstico como la prueba de sudor y estudios moleculares; así como el tamizaje neonatal con la prueba de tripsina inmunoreactiva (IRT) que se realiza sistemáticamente en países del hemisferio norte7. Además, no existen estudios de prevalencia ni de caracterización genética de la enfermedad. No obstante, según los datos estadísticos existentes para América Latina, en el Perú estarían naciendo de 60 a 120 niños con FQ cada año7. Actualmente, en los países desarrollados, los individuos diagnosticados con FQ son sometidos a tratamientos terapéuticos avanzados que les permiten tener una esperanza de vida de 39 años8. En el Perú se conoce menos de 50 pacientes vivos con diagnóstico confirmado, y la gran mayoría son pacientes en edad pediátrica9. Este estudio tiene por objetivo evaluar la frecuencia de diez de las mutaciones más comunes en América Latina7, mediante el Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR (ARMS-PCR, por sus siglas en inglés) en los pacientes con FQ en el Perú.

Los resultados obtenidos en esta investigación son los primeros publicados en el país considerando un número significativo de pacientes.

Materiales y Métodos

DISEÑO Y POBLACIÓN DE ESTUDIO

Se realizó un estudio observacional transversal de tipo descriptivo. La población estuvo compuesta por pacientes con FQ registrados en los dos hospitales especializados de Lima que atienden a la mayoría de pacientes con FQ, el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins (HNERM), perteneciente al Seguro Social del Perú y el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN), del Ministerio de Salud; invitados a través de la Asociación Peruana de FQ (FIQUI-Perú). Los pacientes habían sido previamente diagnosticados mediante la prueba de sudor y no contaban con diagnóstico molecular. El estudio se realizó durante el año 2014. El muestreo fue por conveniencia debido a la baja prevalencia de la enfermedad.

CRITERIOS DE SELECCIÓN

Los criterios de inclusión fueron: haber sido atendido en las dos instituciones previamente detalladas (HNERM y INSN) durante el año 2014 y tener el diagnóstico de FQ con dos pruebas positivas de sudor de sudor (> 60 mEq/L). Se excluyeron aquellos pacientes que no desearon participar en el estudio o se negaban a firmar el consentimiento informado.

ANÁLISIS MOLECULAR

Se recogió una muestra de sangre periférica de cada paciente; posteriormente, las muestras fueron enviadas al Laboratorio de Biotecnología molecular de la Empresa de Investigación y Capacitación en Biotecnología Inca’Biotec/Universidad Nacional de Tumbes. A cada muestra se les realizó una extracción de ADN de las células blancas de la sangre, de acuerdo a protocolos ya probados10. La calidad y concentración del ADN obtenido fue evaluada mediante espectrofotometría de luz ultravioleta con el biofotómetro (Eppendorf(r)).

El ADN aislado de cada paciente fue amplificado con la técnica de Reacción en cadena polimerasa de sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS-PCR) para identificar las diez mutaciones más comunes: p.Phe508del, c.489+1G>T, p.Gly551Asp, p.Asn1303Lys, p.Gly542*, p.Lys1177Serfs*15, c.1585-1G>A, p.Trp1282*, p.Arg553*, p.Arg1162*, usando el kit de ADN Platinum(r) de Invitrogen, a partir de protocolos modificados de las referencias (11, 12).

Para las mutaciones p.Phe508del, c.489+1G>T, p.Asn1303Lys, p.Gly551Asp y p.Gly542*, se desarrollaron cuatro mezclas. En cada una de las mezclas se incluyeron 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR y 1 U/µL de taq ADN polimerasa. Adicionalmente, en la primera mezcla se agregaron cebadores para: p.Phe508del (normal: 1,5 μM; común: 0,5 μM), c.489+1G>T (normal: 0,5 μM, común: 0,5), p.Asn1303Lys (normal: 2 μM; común: 2 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Phe508del (mutado: 2 μM; común: 2 μM), c.489+1G>T (mutado: 0,25 μM; común: 0,25 μM), p.Asn1303Lys (mutado: 1 μM; común: 1 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la tercera mezcla cebadores para: p.Gly551Asp (mutado: 0,5 μM; común: 0,5 μM), p.Gly542* (mutado: 0,5 μM) y 100 ng/μL de ADN; y en la cuarta mezcla cebadores para: G551D (normal: 0,25 μM; común: 0,5 μM), G542X (normal: 0,25 μM) y 100 ng/μL de ADN. Las cuatro mezclas tuvieron un volumen final de 20 μL cada una. La amplificación se realizó en un termociclador (Biometra - USA), las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 61°C durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para las mutaciones p.Lys1177Serfs*15, c.1585-1G>A se realizaron dos mezclas. Ambas incluyeron 200 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR y 1 U/μL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Adicionalmente, en la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Lys1177Serfs*15 (normal: 2 μM; común: 2 μM), c.1585-1G>A (mutado: 1,5 μM; común: 1,5 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Lys1177Serfs*15 (mutado: 1,5 μM de; común: 1,5 μM), c.1585-1G>A (normal: 0,5 μM; común: 1,5 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue 20 μL. Las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94°C durante 2 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 65 °C durante 30 s, y extensión a 72°C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para el diagnóstico de la mutación p.Arg1162*, se prepararon dos mezclas. Ambas contenían 200 μM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR, 1,25 U/μL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Adicionalmente, en la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Arg1162* (común: 10 μM; normal: 10 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Arg1162* (común: 10 μM; mutado: 10 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue de 20 µL. Las condiciones térmicas fueron desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 95 °C durante 1 min, hibridación durante 30 s (a 63 °C para la primera mezcla y a 60 °C para la segunda mezcla), y extensión a 72 °C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

Para la mutación p.Arg553*, se realizó el protocolo de Single ARMS-PCR en dos mezclas. Ambas contenían 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer de PCR, 1 U/µL de taq ADN polimerasa Platinum(r). Además, en la primera mezcla se agregaron cebadores para: p.Arg553* (común: 0,86 μM; normal: 0,86 μM), AAT1 (0,86 μM), AAT2 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN; en la segunda mezcla cebadores para: p.Arg553* (común: 0,86 μM; mutado: 0,86 μM), AAT1 (0,86 μM), AAT2 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN. El volumen final de cada una fue de 20 µL. Las condiciones térmicas de amplificación para ambas mezclas fueron desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 2 min, hibridación a 60 °C durante 2 min, y extensión a 72 °C durante 2 min, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min.

También se desarrolló el protocolo de Single ARMS-PCR para la mutación p.Trp1282*, este se realizó en dos mezclas. Ambas contenían 86 μM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1X de buffer para PCR, 1 U/µL de taq ADN polimerasa Platinum(r). En la primera mezcla se incluyeron cebadores para: p.Trp1282* (común: 0,86 μM; normal: 0,86 μM), AAT3 (0,86 μM), AAT4 (0.86 μM) y 100 ng/μL de ADN; la segunda muestra cebadores para: p.Trp1282* (común: 0,86; mutado: 0,86 μM), AAT3 (0,86 μM), AAT4 (0,86 μM) y 100 ng/μL de ADN. Ambas mezclas se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μL. Las condiciones térmicas de amplificación para ambas mezclas fueron desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min (un ciclo), seguido de 35 ciclos de amplificación, desnaturalización a 94 °C durante 45 s, hibridación a 60°C durante 45 s, y extensión a 72 °C durante 45 s, con una etapa de extensión final a 72 °C durante 10 min. Las secuencias de los cebadores utilizados se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de cebadores.

Tabla 1. Secuencias de cebadores usados para la detección de mutaciones mediante la técnica ARMS-PCR.

Los productos de amplificación se separaron por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2% en una cámara electroforética (Cleaver scientific, Reino Unido) y se observaron en un transiluminador (Vilber lourmat, Francia). Los alelos normales y mutados fueron evidenciados por el número de pares de base (pb) y se compararon con controles positivos, obtenidos de Francia (p.Phe508del, p.Gly551Asp, p.Gly542*, p.Asn1303Lys); y controles internos AAT ALFA correspondientes al gen antitripsina13, estos permitieron validar el diagnóstico.

Los tamaños de los amplicones obtenidos fueron estimados gracias al uso de marcador de peso molecular (MPM) de 100 pb obtenidos de Promega.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos se analizaron utilizando estadística de tipo descriptiva. Los datos cualitativos fueron expresados como frecuencia y porcentaje.

ASPECTOS ÉTICOS

El presente estudio fue aprobado por los comités de ética del HNERM y el INSN. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de cada padre o apoderado de los niños considerados en este estudio.

RESULTADOS

La búsqueda de casos para incluirlos en nuestro estudio nos permitió identificar al total de pacientes con FQ con atención médica en el Perú en el momento del estudio, los cuales fueron 49 pacientes. Algunos de estos ya tenían el diagnóstico genético que había sido realizado en laboratorios de fuera del país (Estados Unidos, Chile y Francia).

El presente estudio incluyó 36 pacientes peruanos con FQ. El rango de edad de los pacientes estuvo comprendido entre el primer año 8 meses y los 19 años de edad. La edad promedio fue de 8 años 6 meses. Diecinueve casos (52,8%) fueron varones. La procedencia de los pacientes correspondió a la ciudad de Lima con 26 casos (72,2%) seguida de Arequipa con 2 (5,6%), y otras ocho ciudades (Amazonas, Junín, Ancash, Cajamarca, Ica, Tacna, La Libertad y Loreto) que contribuyeron con un caso cada una (2,8%).

Quince de los 36 pacientes (41.6%) fueron positivos para al menos una de las diez mutaciones evaluadas. Asimismo, se detectaron tres (p.Phe508del, p.Gly542*, p.Arg1162*) de las diez mutaciones más frecuentes evaluadas. De los 72 alelos analizados, 22 fueron positivos (30,6%). La mutación p.Phe508del fue la más frecuente y se encontró en 16 de un total de 72 alelos (22,2%), la mutación p.Gly542* en cinco alelos (6,9%), y la mutación p.Arg1162* en un alelo (1,4%) (Tabla 2).

Tabla 2. Frecuencia alélica relativa de las mutaciones encontradas en los pacientes peruanos con FQ

Se identificaron mutaciones en ambos alelos en siete de 36 pacientes (19,5%) y al menos una mutación en ocho de 36 (22,2%) pacientes. No se encontraron mutaciones en 21 de 36 pacientes.

En el caso de frecuencia genotípica, el genotipo más frecuente fue el p.Phe508del/ND que estuvo presente en cinco de los 36 pacientes (13,9%), seguido del genotipo p.Phe508del/p.Phe508del con cuatro pacientes (11,1%) y p.Gly542*/ND con 3 pacientes (8,33%) (Tabla 3).

Tabla 3. Frecuencia genotípica relativa de las mutaciones encontradas en pacientes peruanos con fibrosis quística

Discusión

A pesar de que los pacientes eran de diez ciudades del Perú, la mayoría de estos provenían de la ciudad de Lima, lo que podría explicarse porque en esta ciudad se encuentran la mayoría de instituciones que tratan la FQ y por tanto las que con más frecuencia detectarían la enfermedad.

Dentro de las diez mutaciones estudiadas, nuestro estudio solo encontró tres (p.Phe508del, p.Gly542* y p.Arg1162*). Estos resultados contrastan con lo que se esperaba encontrar al considerar las mutaciones más frecuentes de la región de acuerdo a un estudio publicado previamente7; y nos indicaría que la población de nuestro país podría presentar mutaciones diferentes, quizá producto del mestizaje u otro factor no considerado.

La mutación p.Phe508del, la más representativa a nivel mundial2, fue también la más común en nuestro estudio (22.2%); sin embargo, al compararla con otros países, la frecuencia fue inferior al promedio latinoamericano (46,7%) o a países como Argentina (59,2%), Uruguay (56,6%), Brasil (43,1%), Chile (39,3%), Cuba (34,0%) y Ecuador (31,4%), aunque fue ligeramente superior a Costa Rica (22,9%)7.

La mutación p.Gly542* fue la segunda mutación más frecuente. Esta mutación se encuentra en el exón 11 del gen CFTR y pertenece a la clase de mutaciones I. Es la segunda más difundida en el mundo, se encuentra con una prevalencia más o menos constante y presenta una baja varianza entre poblaciones14. Su presencia en la población peruana se explicaría por la fuerte inmigración española que recibieron los países latinoamericanos.

En nuestro estudio, esta mutación tuvo una frecuencia (6,9%) más alta en comparación con Argentina (4,9%) o Ecuador (2%), similar a Brasil (5,3%) y Chile (5,6%), e inferior respecto a Uruguay (7,9%) o Costa Rica, país que presenta una frecuencia de 25%7. La mutación p.Arg1162* fue la tercera mutación hallada en nuestro estudio (un alelo; 1,4%) y su frecuencia fue mayor si se compara con países de Latinoamérica (0,01%); sin embargo, esta prevalencia podría ser sobreestimada debido al tamaño relativamente reducido de la población estudiada, además que esta mutación solo fue encontrada en un paciente heterocigoto (Tabla 3). La combinación de un alelo mutado de tipo p.Arg1162* con otro de tipo p.Phe508del conduce a varios síntomas severos que incluyen la afección hepática; p.Arg1162* es una mutación sin sentido, muy común en el noreste de Italia15. No pudimos detectar las mutaciones causantes de FQ en el 58,3% de los pacientes analizados. Esto se debió a que solo evaluamos las diez mutaciones más comunes en Latinoamérica y usamos un kit casero de ARMS-PCR. Es posible que los pacientes peruanos sean portadores de varias mutaciones y tengan una heterogeneidad genética alta tal como se ha mostrado en otros países latinoamericanos16.

Como dato adicional, se identificaron a once pacientes que ya tenían diagnóstico genético y cuyos resultados fueron colectados mediante encuestas directas realizadas por la asociación FIQUI Perú9. De esta población todos los pacientes mostraron ser heterocigotos compuestos, siendo la mutación p.Phe508del la más frecuente (31,8%; 7/22). Asimismo, en el mismo grupo se identificaron mutaciones raras como p.Arg1162*, p.Gln220*, p.Gly551Asp, p.Phe57Leu, c.1116+2T>C, c.2657+5G>A, p.Arg334Trp, p.Lys684Serfs*38, p.Arg347Pro y p.Lys1177Serfs*15, presentes como un alelo único. La mayor frecuencia del alelo p.Phe508del en comparación a nuestro estudio probablemente ocurra debido al pequeño tamaño de pacientes incluidos en este subgrupo y porque tres de estos pacientes eran hermanos, por lo tanto tenían las mismas mutaciones. Esta información no publicada en otra serie se suma a nuestros resultados, y ambos resaltan la heterogeneidad racial del país y confirmarían la hipótesis de que existen mutaciones poco comunes en nuestra población.

La identificación de las mutaciones presentes en los alelos del CFTR es de suma importancia para los pacientes, no solamente porque son confirmativas de la enfermedad sino también porque diferentes moléculas farmacéuticas han demostrado poder corregir completamente o atenuar los signos clínicos de la enfermedad, pero de forma específica a ciertas mutaciones (17, 18). Estos moduladores del CFTR incluyen potenciadores como el Ivacaftor VX-770 (nombre comercial: Kalydeco(r)) para pacientes con la mutación G551D, que incrementa el tráfico del cloruro por el canal del CFTR (mutaciones de clase III) 19; correctores como el Lumacaftor VX-809 para pacientes con mutación p.Phe508del en forma homocigota, que mejora el plegamiento y el tráfico de la proteína CFTR anormal (mutaciones clase II) y que actualmente es comercializado como Orkambi(r) (lumacaftor + ivacaftor)20; y otras moléculas como el Ataluren, el cual está siendo evaluado en ensayos clínicos (nivel III), que corregiría las mutaciones que generan la aparición de un codón stop prematuro como la p.Arg1162* (mutaciones de clase I)21, 22. Este estudio permitió resaltar que las frecuencias de las mutaciones evaluadas fueron relativamente bajas y que probablemente fueron adquiridas de descendientes europeos. Se requiere de otros estudios que permitan evaluar una mayor cantidad de mutaciones usando kits de ARMS-PCR que son comercialmente disponibles en otros países. No obstante, si analizamos las bajas coberturas que estos kits presentan para la población sudamericana, existe una clara necesidad de ampliar herramientas de secuenciamiento de ADN de próxima generación (en inglés: Next Generation Sequencing)23 para aumentar las tasas de detección. Por otra parte, las herramientas de secuenciación directa del CFTR y la búsqueda de reordenamientos genómicos permitirán detectar posibles mutaciones prevalentes a nivel regional y mutaciones raras (privados) que no se encuentran con las pruebas de mutaciones específicas propuestas por los kits de ARMS-PCR 24,25. Nuestro estudio servirá como base para el establecimiento de futuras iniciativas de prevención que permitan el tamizaje de las mutaciones más frecuentes en la población general con el fin de identificar a eventuales portadores (hermanos, primos, etc.), futuros esposos, o permitir la fertilización in vitro con selección de embriones sanos en el caso de parejas portadoras.

En conjunto, la implementación en el país de herramientas de diagnóstico molecular permitiría la confirmación del diagnóstico, garantizaría un asesoramiento genético adecuado y lograría que los pacientes portadores de ciertas mutaciones puedan acceder a tratamientos curativos o paliativos que mejoren su calidad de vida26. Para luchar contra la FQ de forma más eficaz y mejorar la esperanza de vida de los pacientes peruanos, el país debería implementar una estrategia de diagnóstico sistemático con pruebas de tamizaje neonatal por IRT y establecer laboratorios de diagnóstico confirmativo por pruebas de sudor y equipos de diagnóstico molecular capaces de realizar pruebas genéticas de escaneo del gen CFTR.

 

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