Revista Bioreview Edición 76 - Diciembre 2017

BIODIAGNOSTICO
LABORATORIO DE MEDICINA
ROCHE

 

La importancia de medir HbA1c por el método de referencia internacional

Hemoglobina glicosilada por HPLC, ahora al alcance de su laboratorio

Bioq. Maximiliano Cifarelli. Educador en Diabetes. Contacto: maximiliano.cifarelli@bernardolew.com.ar
Bioq. Ivonne Madelon. Contacto: ivonne.madelon@bernardolew.com.ar

 

La HbA1c está disponible como prueba de laboratorio para uso clínico desde finales de los 70 [1]. Pero no fue hasta los 90 que cobró protagonismo en el control de la diabetes, cuando se demostró su utilidad a partir de dos grandes estudios: el DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) en pacientes con diabetes tipo 1 [2] y el UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) en pacientes con diabetes tipo 2 [3].

Estandarización en la medición de HbA1c

En 1992, el College of American Pathologists (CAP) publicó un estudio que mostraba la gran variabilidad  analítica de la prueba en ese momento; en los diferentes laboratorios clínicos se podían obtener resultados tan dispares para la misma muestra que iban del 4 al 8,1% [4], pudiendo ubicar a un mismo paciente en un nivel de normoglucemia, o directamente en el rango de diabetes.

Como respuesta a esa situación y ante la necesidad de tener una prueba suficientemente confiable, la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) creó un grupo de trabajo con el objetivo de estandarizar la medición de la HbA1c, incluyendo la preparación y evaluación de material de referencia y el desarrollo de un método de referencia internacional [5].

En 2007 se publicó la Declaración de Consenso. Posteriormente en 2010, la American Diabetes Asociation (ADA), gracias a la estandarización y la  madurez que alcanzó la prueba, la incorporó como criterio diagnóstico de diabetes [6]. Consenso que fue ratificado posteriormente [7].

Aspectos técnicos relacionados con la medición de la HbA1c

Determinar con qué instrumento y con qué metodología medir la concentración de HbA1c es una decisión de suma importancia que implica mucha  responsabilidad por parte del laboratorio clínico, más aún, teniendo en cuenta que en el mercado IVD hay una amplia gama de alternativas, las cuales varían en cuanto a la tecnología utilizada, el desempeño analítico y el grado de automatización, circunstancias que tienen impacto en la calidad analítica del resultado y en el costo de la prueba.

El conocimiento de los aspectos tecnológicos es de vital importancia  para tener pruebas confiables y aplicables a los pacientes, y por esto debe ser analizado al máximo por los profesionales del laboratorio clínico, responsables de que las pruebas sean de óptima calidad, y con la mejor relación costo- beneficio.

En el caso de la HbA1c no hay que perder de vista las recomendaciones del Comité de Expertos Internacionales y la ADA en el  sentido de que, para que la prueba pueda ser utilizada como criterio de diagnóstico, debe ser realizada en un laboratorio clínico que utilice  instrumentos y reactivos certificados por el NGSP y estandarizados de acuerdo con las especificaciones del DCCT (Diabetes Control and  Complications Trial) [8].

Metodologías disponibles para la determinación de HbA1c

En la práctica, definir con cuál método y con qué reactivos trabajar depende de muchos factores, en donde debe primar el desempeño analítico, con  resultados precisos y exactos.

Los métodos para medir la concentración de HbA1c se basan en diferencias entre las moléculas la hemoglobina glicosilada y hemoglobina no glicosilada, ya sean físicas, químicas o inmunológicas.

Imagen 1. 

Los métodos cromatográficos se subdividen en dos grandes grupos diametralmente diferentes: la cromatografía de columna y la cromatografía líquida de alta eficiencia/eficacia (HPLC).

En los últimos años, los métodos basados en la cromatografía de columnas fueron sustituidos por sistemas automatizados más sólidos entre los que se destaca la cromatografía líquida de alta eficiencia o HPLC (del inglés, High Performance Liquid  Chromatography) [9]. El método de HPLC fue el utilizado por el DCCT y se convirtió en el método de referencia [10, 11]. La comunidad científica especializada en diabetología considera a la HPLC como el “gold standard” para la determinación cuantitativa de HbA1c en sangre entera.

Partiendo de las diferencias estructurales que hay entre la hemoglobina glicosilada en general, la HbA1c en particular, y la Hb0, es posible separar y  cuantificar estas fracciones.

Este método no se afecta por el pH ni la temperatura, como tampoco se afecta por la presencia de hemoglobinopatías o falla renal por la presencia de hemoglobina carbamilada, ni por la fracción lábil de la hemoglobina glicada [12,13], por lo cual es considerado como el método de referencia para la medición de la HbA1c [11].

Estos sistemas utilizan una columna para eluir la muestra en diferentes fracciones: HbA1a,  HbA1b, HbA1c y HbA0, sucesivamente, utilizando distintos tampones/buffers con diferente fuerza iónica y pH. Este método presenta una excelente precisión y permite una separación rápida de la HbA1c.

Imagen 2. 

Un inconveniente que subsistía hasta hace poco tiempo, era que el alto costo de los equipos y su funcionamiento sólo lo podían soportar los  laboratorios grandes o instituciones de investigación.

De acuerdo con los organismos internacionales relacionados con la diabetes, los laboratorios clínicos europeos muestran una imagen en donde el 70% de ellos utiliza HPLC, 25% métodos inmunológicos, y unos pocos cromatografía de afinidad [14]. En nuestro medio no se conoce la proporción, pero ahora está disponible toda esta tecnología y al alcance de la mayoría de los laboratorios.

Es muy importante que los laboratorios clínicos en la medida de sus posibilidades y a la mayor brevedad posible, puedan migrar a metodologías certificadas [15].

Analizador automatizado H50P de HbA1c por HPLC de Mindray

El H50P es un equipo de cromatografía líquida de alta performance (HPLC), con un alto rendimiento: 50 muestras por hora, accesible para la mayoría de los laboratorios clínicos, destacándose en la detección de Hemoglobina glicosilada por su excelente precisión.

Con un CV menor al 1%, H50P demuestra su alta precisión ofreciendo resultados más confiables y cobrando principal importancia en aquellos  resultados que se encuentran alrededor de 6,5% de HbA1c, valor establecido como punto de corte para el diagnóstico de diabetes mediante esta metodología. Es este análisis de precisión el que llevó al H50P a alcanzar la certificación del National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) y la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC).

Además de informar la fracción de HbA1c en % y unidades de mmol /mol, también informa resultados de HbA1 %, HbF % y eAG en mmol /L y mg/dL. Este último índice llamado “glucemia media estimada” o eAG, por sus siglas en inglés (Estimated Average Glucose) [16], no se trata de un nuevo parámetro, sino de una nueva forma de expresar el porcentaje de la HbA1c: se refiere a los resultados de la HbA1c convertida a un nivel promedio de glucemia en unidades de medida más familiares para los pacientes. Tanto la ADA como la American Association for Clinical Chemistry (AACC) esperan que el uso de este nuevo término ayude a los pacientes y a sus médicos a realizar los cambios necesarios en el tratamiento para mejorar su estado de salud en general.

Imagen 3. Resultados reproducibles a diferentes niveles de concentración.

Imagen 4.

Otro aspecto a destacar, es que utiliza columnas de intercambio iónico muy fáciles de reemplazar por el usuario, con una vida útil estimada en 6000 muestras, y solo 3 reactivos de carga continua entre hemolizante y eluentes, que se incorporan al equipo mediante radiofrecuencia, lo que garantiza una mejor trazabilidad en el trabajo diario del laboratorio. Para conocer más de este instrumento ingrese a www.bernardolew.com.ar

Conclusión

La medición de la HbA1c es un eje central tanto en el control de los pacientes con diabetes, ya que de acuerdo a sus valores se han establecido las  metas de control y tratamiento, como en el control de las complicaciones a mediano y largo plazo.

La HPLC fue el método utilizado por el DCCT y es considerado el “gold standard” por su alta precisión, con un CV menor al 1% y resultados más confiables, cobrando principal importancia en aquellos que se encuentran alrededor de 6,5% de HbA1c, valor que la ADA ha establecido como punto de corte para el diagnóstico  de diabetes, y que solo recomienda realizar mediante esta metodología.

Los laboratorios clínicos deben hacer los cambios necesarios para alcanzar las metas de desempeño analítico, participando activamente en  programas de calidad a nivel nacional e internacional para cumplir el requerimiento de los organismos internacionales, como es la instrumentación y los materiales utilizados certificados por el NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) y estandarizados de acuerdo con las especificaciones del DCCT (Diabetes Control and Complications Trial). 

Referencias Bibliográficas

1. Gonen B, Rubenstein A, Rochman H, Tanega SP, Horwitz DL. Haemoglobin A1: An indicator of the metabolic control of diabetic patients. Lancet  1977; 2: 734-737.

2. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl J Med 1993; 329: 977-986.

3. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet 1998; 352: 837-853.

4. Little RR, Wiedmeyer HM, England JD, Wilke AL, Rohlfing CL, Wians FH, Jr., et al. Interlaboratory standardization of measurements of  glycohemoglobins. Clin Chem 1992; 38: 2472-2478.

5. Finke A, Kobold U, Hoelzel W, Weykamp C, Miedema K, Jeppsson  JO. Preparation of a candidate primary reference material for the international standardisation of HbA1c determinations. Clin Chem Lab Med 1998; 36: 299-308.

6. Standards of medical care in diabetes-2010. Diabetes Care 2010;33 Suppl 1: S11-61.

7. Hanas R, John G. 2010 Consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin a1c measurement. Clin Chem 2010; 56: 1362-1364.

8. International Expert Committee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care 2009; 32: 1327-1334.

9. John WG, Braconnier F, Miedema K, Aulesa C, Piras G. Evaluation of the Menarini-Arkray HA 8140 hemoglobin A1c analyzer. Clin Chem 1997; 43: 968-975.

10. Little RR, Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Myers GL, Sacks DB, Goldstein DE. The National Glycohemoglobin Standardization Program: a five-year progress report. Clin Chem 2001; 47: 1985- 1992.

11. Jeppsson JO, Kobold U, Barr J, Finke A, Hoelzel W, Hoshino T, et al. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human  Blood. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 78-89.

12. Weykamp C, John WG, Mosca A. A review of the challenge in measuring hemoglobin A1c. J Diabetes Sci Technol 2009; 3: 439-445.

13. Little RR, Roberts WL. A review of variant hemoglobins interfering with hemoglobin A1c measurement. J Diabetes Sci Technol
2009; 3: 446-451.
14. European Reference Laboratory. Disponible: http://www.euroreflab.com

15. List of NGSP certified methods. Disponible: http://www.ngsp.org/docs/methods.pdf. Updated 2017.

16. Nathan DM, Kuenen J, Borg R, Zheng H, Schoenfeld D, Heine RJ. Translating the A1C assay into estimated average glucose values. Diabetes Care 2008; 31: 1473-1478.

La HbA1c está disponible como prueba de laboratorio para uso clínico desde finales de los 70 [1]. Pero no fue hasta los 90 que cobró protagonismo en el control de la diabetes, cuando se demostró su utilidad a partir de dos grandes estudios: el DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) en pacientes con diabetes tipo 1 [2] y el UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) en pacientes con diabetes tipo 2 [3].

Estandarización en la medición de HbA1c

En 1992, el College of American Pathologists (CAP) publicó un estudio que mostraba la gran variabilidad  analítica de la prueba en ese momento; en los diferentes laboratorios clínicos se podían obtener resultados tan dispares para la misma muestra que iban del 4 al 8,1% [4], pudiendo ubicar a un mismo paciente en un nivel de normoglucemia, o directamente en el rango de diabetes.

Como respuesta a esa situación y ante la necesidad de tener una prueba suficientemente confiable, la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) creó un grupo de trabajo con el objetivo de estandarizar la medición de la HbA1c, incluyendo la preparación y evaluación de material de referencia y el desarrollo de un método de referencia internacional [5].

En 2007 se publicó la Declaración de Consenso. Posteriormente en 2010, la American Diabetes Asociation (ADA), gracias a la estandarización y la  madurez que alcanzó la prueba, la incorporó como criterio diagnóstico de diabetes [6]. Consenso que fue ratificado posteriormente [7].

Aspectos técnicos relacionados con la medición de la HbA1c

Determinar con qué instrumento y con qué metodología medir la concentración de HbA1c es una decisión de suma importancia que implica mucha  responsabilidad por parte del laboratorio clínico, más aún, teniendo en cuenta que en el mercado IVD hay una amplia gama de alternativas, las cuales varían en cuanto a la tecnología utilizada, el desempeño analítico y el grado de automatización, circunstancias que tienen impacto en la calidad analítica del resultado y en el costo de la prueba.

El conocimiento de los aspectos tecnológicos es de vital importancia  para tener pruebas confiables y aplicables a los pacientes, y por esto debe ser analizado al máximo por los profesionales del laboratorio clínico, responsables de que las pruebas sean de óptima calidad, y con la mejor relación costo- beneficio.

En el caso de la HbA1c no hay que perder de vista las recomendaciones del Comité de Expertos Internacionales y la ADA en el  sentido de que, para que la prueba pueda ser utilizada como criterio de diagnóstico, debe ser realizada en un laboratorio clínico que utilice  instrumentos y reactivos certificados por el NGSP y estandarizados de acuerdo con las especificaciones del DCCT (Diabetes Control and  Complications Trial) [8].

Metodologías disponibles para la determinación de HbA1c

En la práctica, definir con cuál método y con qué reactivos trabajar depende de muchos factores, en donde debe primar el desempeño analítico, con  resultados precisos y exactos.

Los métodos para medir la concentración de HbA1c se basan en diferencias entre las moléculas la hemoglobina glicosilada y hemoglobina no glicosilada, ya sean físicas, químicas o inmunológicas.

Imagen 1. 

Los métodos cromatográficos se subdividen en dos grandes grupos diametralmente diferentes: la cromatografía de columna y la cromatografía líquida de alta eficiencia/eficacia (HPLC).

En los últimos años, los métodos basados en la cromatografía de columnas fueron sustituidos por sistemas automatizados más sólidos entre los que se destaca la cromatografía líquida de alta eficiencia o HPLC (del inglés, High Performance Liquid  Chromatography) [9]. El método de HPLC fue el utilizado por el DCCT y se convirtió en el método de referencia [10, 11]. La comunidad científica especializada en diabetología considera a la HPLC como el “gold standard” para la determinación cuantitativa de HbA1c en sangre entera.

Partiendo de las diferencias estructurales que hay entre la hemoglobina glicosilada en general, la HbA1c en particular, y la Hb0, es posible separar y  cuantificar estas fracciones.

Este método no se afecta por el pH ni la temperatura, como tampoco se afecta por la presencia de hemoglobinopatías o falla renal por la presencia de hemoglobina carbamilada, ni por la fracción lábil de la hemoglobina glicada [12,13], por lo cual es considerado como el método de referencia para la medición de la HbA1c [11].

Estos sistemas utilizan una columna para eluir la muestra en diferentes fracciones: HbA1a,  HbA1b, HbA1c y HbA0, sucesivamente, utilizando distintos tampones/buffers con diferente fuerza iónica y pH. Este método presenta una excelente precisión y permite una separación rápida de la HbA1c.

Imagen 2. 

Un inconveniente que subsistía hasta hace poco tiempo, era que el alto costo de los equipos y su funcionamiento sólo lo podían soportar los  laboratorios grandes o instituciones de investigación.

De acuerdo con los organismos internacionales relacionados con la diabetes, los laboratorios clínicos europeos muestran una imagen en donde el 70% de ellos utiliza HPLC, 25% métodos inmunológicos, y unos pocos cromatografía de afinidad [14]. En nuestro medio no se conoce la proporción, pero ahora está disponible toda esta tecnología y al alcance de la mayoría de los laboratorios.

Es muy importante que los laboratorios clínicos en la medida de sus posibilidades y a la mayor brevedad posible, puedan migrar a metodologías certificadas [15].

Analizador automatizado H50P de HbA1c por HPLC de Mindray

El H50P es un equipo de cromatografía líquida de alta performance (HPLC), con un alto rendimiento: 50 muestras por hora, accesible para la mayoría de los laboratorios clínicos, destacándose en la detección de Hemoglobina glicosilada por su excelente precisión.

Con un CV menor al 1%, H50P demuestra su alta precisión ofreciendo resultados más confiables y cobrando principal importancia en aquellos  resultados que se encuentran alrededor de 6,5% de HbA1c, valor establecido como punto de corte para el diagnóstico de diabetes mediante esta metodología. Es este análisis de precisión el que llevó al H50P a alcanzar la certificación del National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) y la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC).

Además de informar la fracción de HbA1c en % y unidades de mmol /mol, también informa resultados de HbA1 %, HbF % y eAG en mmol /L y mg/dL. Este último índice llamado “glucemia media estimada” o eAG, por sus siglas en inglés (Estimated Average Glucose) [16], no se trata de un nuevo parámetro, sino de una nueva forma de expresar el porcentaje de la HbA1c: se refiere a los resultados de la HbA1c convertida a un nivel promedio de glucemia en unidades de medida más familiares para los pacientes. Tanto la ADA como la American Association for Clinical Chemistry (AACC) esperan que el uso de este nuevo término ayude a los pacientes y a sus médicos a realizar los cambios necesarios en el tratamiento para mejorar su estado de salud en general.

Imagen 3. Resultados reproducibles a diferentes niveles de concentración.

Imagen 4.

Otro aspecto a destacar, es que utiliza columnas de intercambio iónico muy fáciles de reemplazar por el usuario, con una vida útil estimada en 6000 muestras, y solo 3 reactivos de carga continua entre hemolizante y eluentes, que se incorporan al equipo mediante radiofrecuencia, lo que garantiza una mejor trazabilidad en el trabajo diario del laboratorio. Para conocer más de este instrumento ingrese a www.bernardolew.com.ar

Conclusión

La medición de la HbA1c es un eje central tanto en el control de los pacientes con diabetes, ya que de acuerdo a sus valores se han establecido las  metas de control y tratamiento, como en el control de las complicaciones a mediano y largo plazo.

La HPLC fue el método utilizado por el DCCT y es considerado el “gold standard” por su alta precisión, con un CV menor al 1% y resultados más confiables, cobrando principal importancia en aquellos que se encuentran alrededor de 6,5% de HbA1c, valor que la ADA ha establecido como punto de corte para el diagnóstico  de diabetes, y que solo recomienda realizar mediante esta metodología.

Los laboratorios clínicos deben hacer los cambios necesarios para alcanzar las metas de desempeño analítico, participando activamente en  programas de calidad a nivel nacional e internacional para cumplir el requerimiento de los organismos internacionales, como es la instrumentación y los materiales utilizados certificados por el NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) y estandarizados de acuerdo con las especificaciones del DCCT (Diabetes Control and Complications Trial). 

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