Revista Bioreview Edición 65 - Enero 2017

BIODIAGNOSTICO
LABORATORIO DE MEDICINA

 

Genotipificación del virus del papiloma humano en mujeres que asisten a un hospital gineco-obstétrico de tercer nivel de la Ciudad de México

Saúl Flores-Medina, PhD.1,2, Carmen Selene García-Romero, PhD.1, Diana Mercedes Soriano-Becerril, MSc.1, Ricardo Figueroa-Damián1, Gonzalo
Márquez-Acosta.3
1 Departamento de Infectología e Inmunología, Instituto Nacional de Perinatología.
2 CECyT No. 15 “DAE” Instituto Politécnico Nacional,
3 Coordinación de Colposcopia, Instituto Nacional de Perinatología. Ciudad de México, México.
Revista chilena de obstetricia y ginecología
versión On-line ISSN 0717-7526
Rev. chil. obstet. ginecol. vol.81 no.5 Santiago 2016
http://dx.doi.org/10.4067/S0717-75262016000500006
Román Díaz #205, Depto. 205, Providencia, Santiago, Chile
Tel.: (56-2) 22350133
Fax: (56-2) 22351294
sochog@entelchile.net

Resumen

Objetivo: Determinar la frecuencia de infección por el virus del papiloma humano en pacientes que acudieron a un hospital de tercer nivel de atención  en la Ciudad de México. Método: Se realizó un estudio prospectivo, transversal y descriptivo que incluyó 65 mujeres entre 15 a 46 años que  asistieron a consulta para atención gineco-obstétrica. A todas las participantes se les tomó una muestra cervical para la detección/genotipificación del papiloma virus mediante la prueba Linear Array HPV Genotyping Test in vitro® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Resultados: Un total de 36 (55,4%) pacientes resultaron positivas al virus, en las que se identificaron 65 genotipos virales tanto en infección única (38,9%) como en  infección por múltiples (61,1%) genotipos. El 29,2% de los genotipos identificados, fueron de alto riesgo. Los genotipos de alto riesgo más  frecuentes fueron: VPH52 y 51; mientras que los genotipos de bajo riesgo más comunes fueron: VPH6 y 53. Un tercio de las pacientes con infección mostraron al menos un genotipo de alto riesgo. Conclusión: En este estudio, se observó una frecuencia relativamente baja de genotipos de alto  riesgo del virus del papiloma humano, sin embargo se identificó un porcentaje importante de co-infección por múltiples genotipos. Por esta razón, se  considera necesario dar seguimiento a mediano y largo plazo para monitorear la evolución de la infección.

Palabras Clave: Virus del papiloma humano, genotipos de alto riesgo, cáncer cervical, coinfección, prevalencia

Summary

Objective: To identify which are the most frequent genotypes of human papilloma virus among a group of gynecologic-obstetric patients at tertiary  care hospital in Mexico City. Method: A prospective and descriptive cross-sectional study was carried out among a group of 65 women, aged 15-46  years, receiving gynecological-obstetric care. Cervical specimens were taken from all participants for direct HPV detection/ genotyping by means of a Linear Array HPV Genotyping Test in vitro® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Results: Virus detection was achieved in 36 patients (55.4%), with a total of 65 genotypes, either as single (38.9%) or multiple-genotype (61.1%) infections. High risk genotypes accounted for only 29.2% of all genotype. The most frequent high risk genotypes were HPV52 and 51, while HPV6 and 53 were the most frequent low risk ones. At least one high risk genotype was present in one third of infected patients. Conclusion: The relative low frequency of oncogenic human papilloma virus genotypes among the women in this study was observed, however a significant percentage of co-infection with multiple genotypes were identified. Thus, mid- to long-term follow up might be necessary for those patients to monitor the evolution of the infection.

Keywords: Human papilloma virus, high risk genotypes, cervical cancer, multiple-genotype infection, frequency

Introducción

En mujeres el principal factor de riesgo para desarrollar lesiones epiteliales pre-malignas y malignas en cérvix, vagina o vulva, suele ser la infección  persistente por ciertos genotipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) (1,2), sin embargo, no es causa exclusiva y otros factores de  riesgo están involucrados, incluyendo: inicio de relaciones sexuales a temprana edad, múltiples parejas sexuales, prácticas sexuales de riesgo, respuesta inmunitaria deficiente del huésped, predisposición genética, tabaquismo, otras infecciones de transmisión sexual y el uso de  anticonceptivos orales, entre otros (3-5).

Los genotipos de VPH que afectan el tracto genito-urinario se clasifican en genotipos de alto riesgo  relacionados al desarrollo de cáncer y genotipos de bajo riesgo asociados a la aparición de condilomas (4,6). De acuerdo a la variación en su material genético, se han caracterizado 40 genotipos de VPH que infectan la región ano-genital en el humano, de ellos 15 se reconocen como virus oncogénicos que afectan el epitelio escamoso y estratificado (3,6).

Se ha informado que la prevalencia de infección por VPH en mujeres embarazadas es muy variada, con frecuencias que van desde 5% hasta 70%, dependiendo de la persistencia de la infección (7,8).

El objetivo del presente estudio fue identificar los genotipos más frecuentes del VPH en pacientes gineco-obstétricas que asistieron al Instituto  Nacional de Perinatología de la Ciudad de México.

Pacientes y Método

Se realizó un estudio prospectivo, transversal y descriptivo que incluyó un total de 65 mujeres de entre 15 a 46 años originarias en su mayoría de la  Ciudad de México y zonas conurbadas del Estado de México, las cuales asistieron al Instituto Nacional de Perinatología (INPer) Isidro Espinosa de  los Reyes ubicado en la Ciudad de México, para cuidado prenatal, resolución del embarazo o atención de problemas ginecológicos, previo   consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Instituto con el número de protocolo: 212250-22761.  Todas las participantes respondieron un cuestionario acerca de aspectos socio-demográficos.

Muestras. A todas las mujeres se les tomaron dos  muestras de exudado cervical. La primera para el estudio de Papanicolaou y la segunda para la genotipificación de VPH. Ésta última se depositó en un vial que contenía medio de transporte Preserv-Cyt Solution (MA, USA) y se congeló a -20oC  hasta su procesamiento.

Genotipificación del VPH. Se empleó la prueba in vitro “Linear Array HPV Genotyping Test” (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) para la detección simultánea de hasta 37 genotipos virales, incluyendo trece de alto riesgo (VPH16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y veinticuatro de bajo riesgo (VPH6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70,71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39, CP6108).

De manera resumida el proceso de genotipificación se realizó de la siguiente forma:

1. Extracción y purificación del DNA empleando solución de lisis (con proteinasa K) y columnas de sepharosa.

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando iniciadores (PGMY) biotinilados específicos para el gen de la región L1 del genoma del  VPH e iniciadores específicos para el gen constitutivo de la p-globina, como control de calidad del DNA. La amplificación se realizó en un volumen  final de 100 μL, conteniendo 50 μL de la mezcla de reacción, 40 μL de agua y 10 μL del DNA purificado, según el siguiente protocolo: incubación  inicial a 50°C durante 2 minutos e incubación a 95° C durante 9 min, seguidas por 40 ciclos de amplificación (95°C/30 segundos, 55°C/1 minuto y  72°C/1 minuto) y una extensión final de 72°C durante 10 minutos. En cada corrida se incluyó un testigo negativo y otro positivo.

3. Hibridación. A  cada tubo con los productos de amplificación se le agregó solución desnaturalizante y se incubó una hora a 37°C. Posteriormente  esta mezcla se vertió sobre tiras de celulosa conteniendo DNA recombinante de cada uno de los 37 genotipos virales y se dejó interactuar durante  20 min/53°C.

4. Detección de los híbridos. Se realizó mediante revelado colorimétrico sobre las tiras de celulosa.

Análisis estadístico. Se empleó estadística descriptiva para los hallazgos socio-demográficos y para la genotipificación de VPH.

Resultados 

El promedio de edad de las mujeres analizadas fue de 28 ± 8,6 años, con un intervalo entre 15 y 46 años. La media de inicio de vida sexual activa fue de 19 ± 4,9 años, teniendo una mediana de 4 parejas sexuales. En la Tabla I se muestran el resto de variables socio-demográficas.

Tabla I. Variables socio-demográficas de 36 mujeres infectadas por el VPH

Se observó una mayor frecuencia de infección por VPH en mujeres con edad superior a los 20 (83%) años, que en mujeres que iniciaron su actividad sexual activa antes de los 20 (69%) años y las que tuvieron más de una (67%) pareja sexual antes del estudio (Figura 1).

Figura 1. Frecuencia de la infección por VPH (n=36) de acuerdo a las variables socio-demográficas.

Respecto a la genotipificación, en 36 pacientes se logró identificar al menos un genotipo de VPH, de tal manera que la frecuencia total de la  infección fue del 55,4%. Entre las pacientes infectadas se identificaron un total de 65 genotipos, de los cuales 19 (29,2%) fueron de alto riego y 46  (70,8%) de bajo riesgo.

Los genotipos de alto riego identificados con mayor frecuencia, fueron: VPH52 (11,1%) y 51 (8,3%), seguidos de VPH16, 31, 35 y 58 con el 5,6%  cada uno. Con relación a los genotipos de bajo riesgo, los más frecuentes fueron: VPH6 (44,4%), 53 (16,7%), 11 y 42 con el 11,1% cada uno (Tabla  II).

Tabla II. Distribución de genotipos de VPH más frecuentemente identificados de acuerdo a riesgo oncogénico.

Por otro lado, 14 (38,9%) mujeres presentaron infección con un solo genotipo, mientras que 22 (61,1%) pacientes estuvieron infectadas simultáneamente con al menos dos o hasta cuatro genotipos diferentes de VPH. El grupo de pacientes infectadas con dos genotipos (47,2%) fue el  de mayor predominio, seguido por el grupo de mujeres infectadas con un genotipo (Tabla III). No se identificó una hegemonía particular entre los  genotipos de VPH en las pacientes co-infectadas. En todos los casos la combinación de estos, fue específica para cada paciente (Tabla IV).

Tabla III. Proporción de mujeres con infección única y coinfección por diferentes genotipos de VPH

Con referencia al grupo de mujeres con infección por VPH, 23 (63,9%) se hallaban embarazadas, de ellas 21 (91,3%) se encontraban en el último  trimestre del embarazo, mientras que 2 (8,7%) pacientes cursaban el segundo trimestre. El resto (36,1%) no estaban embarazadas.

Tabla IV. Distribución de genotipos de VPH de alto y bajo riesgo por paciente identificados en casos de co-infección

En las mujeres que cursaban en su tercer trimestre de embarazo se identificaron un total de 39 genotipos de VPH; con presencia de un solo genotipo (9 casos) y  con hasta cuatro genotipos diferentes por paciente (12 casos). Este grupo mostró 13 genotipos de alto riesgo y 26 de bajo riesgo. Los genotipos de alto riesgo más frecuentes fueron: VPH31 en tres casos, VPH51 y 16 en dos casos, respectivamente; el resto VPH18, 35, 39, 52, 56 y 58 se identificaron en un solo caso, respectivamente. Por su parte, los genotipos de bajo riesgo más comunes fueron: VPH6 en diez casos, 53 en cuatro casos, 11, 42, 66 y CP6108 en dos casos cada uno y 40, 55, 61 y 84 en un solo caso respectivamente. Con respecto a las 2 pacientes con embarazo en el segundo trimestre, una de ellas presentó dos genotipos de alto riesgo (VPH35 y 52), mientras que en la otra paciente se  identificaron VPH6 y 55 que correspondieron a genotipos de bajo riesgo.

Finalmente, los resultados del estudio citológico indicaron que solamente 10/36 (27,8%) pacientes se diagnosticaron con lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG), el resto del grupo no mostró ningún otro tipo de lesión  epitelial. Un total de 19 (29,2%) genotipos fueron identificados en estas mujeres, de ellos 7 correspondieron a genotipos de alto grado (VPH52 y  VPH31 en dos casos; VPH35, VPH51 y VPH58 en un caso, respectivamente), mientras que 12 fueron de bajo riesgo (VPH6 en tres casos, VPH11 y  PH53 en dos casos, VPH42, VPH61, VPH66, VPH71 y VPH83 en un caso, respectivamente).

Discusión

La infección genital provocada por el VPH y la presencia de otros factores aumentan la probabilidad de desarrollar cáncer cervicouterino (4,6). La  prevalencia de la infección se incrementa notablemente dependiendo de la zona geográfica, la edad de las personas infectadas y la conducta sexual ( 1,9,10).

En este estudio, mostramos la distribución de diferentes genotipos de VPH identificados en pacientes que acudieron al INPer para su atención  gineco-obstétrica, ya sea de seguimiento o para resolución del embarazo, de tal manera que la frecuencia total fue del 55% con una distribución  heterogénea de los genotipos oncogénicos y no oncogénicos, acorde con los resultados obtenidos por diversos investigadores (1,9,11).

Con respecto al estudio sociodemográfico, la mayoría de las pacientes tuvo más de una pareja sexual, el inicio de su vida sexual activa fue antes de los 20 años y al momento del estudio las encuestadas mencionaron que no contaban con una pareja estable. En cuanto a su escolaridad, sobresalió que gran parte de ellas tenían menos de 9 años de estudio formal (Tabla I y Figura 1). En este caso, reportes de diversas investigaciones han encontrado una asociación entre las variables antes mencionadas con la adquisición de infección por VPH o el desarrollo de cáncer cervical (12-14). En este estudio  no se encontró ninguna relación significativa entre los aspectos sociodemográficos e infección por VPH.

Múltiples estudios han descrito la presencia de diversos genotipos en diferentes poblaciones de México. Colín- Orozco y cols (11) encontraron  frecuencias del 14,6 %, 8,2% y 7,9% para genotipos de alto riesgo VPH16, 18 y 58, mientras que los genotipos de bajo riesgo más frecuentes fueron VPH11 y 53. Por su parte, Lazcano-Ponce y cols (9), reportaron frecuencias iguales o menores al 2% para genotipos de alto riesgo VPH16,  31 y 18. En otro reporte, Peralta-Rodríguez y cols (15), en un meta-análisis identificaron VPH16, 58 y 18 como los genotipos más frecuentes en el  Oeste del país, para la región Central fueron los genotipos VPH16, 18 y 45, mientras que para la región Sur fueron VPH16, 18 y 31.

En este estudio, la mayoría de las pacientes seleccionadas provenían de la Ciudad de México y zonas conurbadas del Estado de México. Los tipos virales que más se repitieron en estas mujeres fueron, de alto riesgo VPH52, 51, 31, 35, 58, y 16, y de bajo riesgo VPH6, 53, 11 y 42. En los estudios descritos en el párrafo anterior, los autores emplearon PCR acoplado a secuenciación, o bien técnicas de arreglo en línea para 27 genotipos. Las diferencias en  los hallazgos de los diferentes genotipos pudiera ser el resultado de la diversidad en las técnicas de identificación empleadas, las cuales probablemente se enfocan en la detección de genotipos de alto riesgo, sin embargo también se debe considerar la homogeneidad en la toma de la  muestra. En este trabajo, empleamos una técnica de arreglo en línea similar al estudio anterior, pero con la diferencia que detecta hasta 37 genotipos. Observamos que los genotipos de alto riesgo VPH16 y VPH18 fueron detectados en menor frecuencia de lo esperado, sobresaliendo otros genotipos oncogénicos poco reportados en otros estudios (1,15-17).

Es claro que en la mayoría de los estudios existen coincidencias entre los genotipos identificados, sin embargo también existen diferencias en  cuanto al número de genotipos detectados y en cuanto a sus frecuencias, lo que confirma que la zona geográfica, la edad de las pacientes y la  metodología empleada son importantes en la distribución reportada del VPH (15-18).

Cabe destacar que dos terceras partes (61,1%) de las pacientes estudiadas mostraron co-infección con dos y hasta cuatro genotipos diferentes. La  mayoría de estas pacientes (59%) tenían combinaciones de genotipos de alto y bajo riesgo. Se ha sugerido que los genotipos de alto y bajo riesgo  oncogénico pudieran actuar sinérgicamente, de tal manera que se promueva fácilmente el desarrollo de cáncer cervical, a diferencia de aquellas  pacientes infectadas con un solo genotipo (19,20).

La elevada frecuencia de co-infección con genotipos de VPH de alto y bajo riesgo observada en  nuestro estudio, sugiere la necesidad de brindar seguimiento a estas mujeres en un futuro a mediano y largo plazo para detectar y prevenir futuras  complicaciones.

Por otro lado, se ha descrito una alta correlación entre la presencia de genotipos de alto riesgo y diferentes lesiones cervicales (4,15). Dos estudios  realizados en mujeres con lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG), con lesión intraepitelial de alto grado (LIEAG) o cáncer cervical, mostraron  frecuencias de infección por VPH del 56,4% al 99,1%, independiente del tipo de lesión (17,21). Sin embargo, entre ambos estudios, estas frecuencias variaron, principalmente con relación al genotipo de alto grado identificado; así para VPH58 el primer trabajó informó que el 28,5% de las  mujeres infectadas cursaba con algún tipo de lesión, contra solo el 0,7% de las informadas en el segundo estudio. Para el genotipo VPH16, el  primer estudio señaló la presencia de lesiones asociadas en el 25,7% de las mujeres, mientras que el segundo estudio se encontró esta asociación en el 53,4% de los casos estudiados.

En este trabajo, los genotipos de alto riego más frecuentes en las pacientes con LIEBG fueron, VPH52,  VPH31, VPH35, VPH51 y VPH58. Lo que concuerda con diferentes estudios con relación a la asociación que existe con la presencia de ciertos  virus oncogénicos y lesiones epiteliales (15,22).

Conclusiones

Se encontraron frecuencias de VPH16 y 18 por debajo de lo descrito por otros autores, sin embargo otros genotipos de alto riesgo fueron los más  comunes.

El 59% de las pacientes mostraron co-infección con diferentes genotipos de VPH y al menos un genotipo de alto riesgo estuvo presente en ellas. Considerando que la distribución de los diferentes tipos de VPH varían geográficamente y que los genotipos oncogénicos son más prevalentes en ciertas regiones, es importante contar con estudios basados en la población para evaluar el comportamiento de la infección, conocer el curso clínico de la enfermedad y definir la eficacia de las vacunas, de esta manera se ayudará a prevenir en parte el cáncer de cuello uterino.

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Resumen

Objetivo: Determinar la frecuencia de infección por el virus del papiloma humano en pacientes que acudieron a un hospital de tercer nivel de atención  en la Ciudad de México. Método: Se realizó un estudio prospectivo, transversal y descriptivo que incluyó 65 mujeres entre 15 a 46 años que  asistieron a consulta para atención gineco-obstétrica. A todas las participantes se les tomó una muestra cervical para la detección/genotipificación del papiloma virus mediante la prueba Linear Array HPV Genotyping Test in vitro® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Resultados: Un total de 36 (55,4%) pacientes resultaron positivas al virus, en las que se identificaron 65 genotipos virales tanto en infección única (38,9%) como en  infección por múltiples (61,1%) genotipos. El 29,2% de los genotipos identificados, fueron de alto riesgo. Los genotipos de alto riesgo más  frecuentes fueron: VPH52 y 51; mientras que los genotipos de bajo riesgo más comunes fueron: VPH6 y 53. Un tercio de las pacientes con infección mostraron al menos un genotipo de alto riesgo. Conclusión: En este estudio, se observó una frecuencia relativamente baja de genotipos de alto  riesgo del virus del papiloma humano, sin embargo se identificó un porcentaje importante de co-infección por múltiples genotipos. Por esta razón, se  considera necesario dar seguimiento a mediano y largo plazo para monitorear la evolución de la infección.

Palabras Clave: Virus del papiloma humano, genotipos de alto riesgo, cáncer cervical, coinfección, prevalencia

Summary

Objective: To identify which are the most frequent genotypes of human papilloma virus among a group of gynecologic-obstetric patients at tertiary  care hospital in Mexico City. Method: A prospective and descriptive cross-sectional study was carried out among a group of 65 women, aged 15-46  years, receiving gynecological-obstetric care. Cervical specimens were taken from all participants for direct HPV detection/ genotyping by means of a Linear Array HPV Genotyping Test in vitro® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ). Results: Virus detection was achieved in 36 patients (55.4%), with a total of 65 genotypes, either as single (38.9%) or multiple-genotype (61.1%) infections. High risk genotypes accounted for only 29.2% of all genotype. The most frequent high risk genotypes were HPV52 and 51, while HPV6 and 53 were the most frequent low risk ones. At least one high risk genotype was present in one third of infected patients. Conclusion: The relative low frequency of oncogenic human papilloma virus genotypes among the women in this study was observed, however a significant percentage of co-infection with multiple genotypes were identified. Thus, mid- to long-term follow up might be necessary for those patients to monitor the evolution of the infection.

Keywords: Human papilloma virus, high risk genotypes, cervical cancer, multiple-genotype infection, frequency

Introducción

En mujeres el principal factor de riesgo para desarrollar lesiones epiteliales pre-malignas y malignas en cérvix, vagina o vulva, suele ser la infección  persistente por ciertos genotipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) (1,2), sin embargo, no es causa exclusiva y otros factores de  riesgo están involucrados, incluyendo: inicio de relaciones sexuales a temprana edad, múltiples parejas sexuales, prácticas sexuales de riesgo, respuesta inmunitaria deficiente del huésped, predisposición genética, tabaquismo, otras infecciones de transmisión sexual y el uso de  anticonceptivos orales, entre otros (3-5).

Los genotipos de VPH que afectan el tracto genito-urinario se clasifican en genotipos de alto riesgo  relacionados al desarrollo de cáncer y genotipos de bajo riesgo asociados a la aparición de condilomas (4,6). De acuerdo a la variación en su material genético, se han caracterizado 40 genotipos de VPH que infectan la región ano-genital en el humano, de ellos 15 se reconocen como virus oncogénicos que afectan el epitelio escamoso y estratificado (3,6).

Se ha informado que la prevalencia de infección por VPH en mujeres embarazadas es muy variada, con frecuencias que van desde 5% hasta 70%, dependiendo de la persistencia de la infección (7,8).

El objetivo del presente estudio fue identificar los genotipos más frecuentes del VPH en pacientes gineco-obstétricas que asistieron al Instituto  Nacional de Perinatología de la Ciudad de México.

Pacientes y Método

Se realizó un estudio prospectivo, transversal y descriptivo que incluyó un total de 65 mujeres de entre 15 a 46 años originarias en su mayoría de la  Ciudad de México y zonas conurbadas del Estado de México, las cuales asistieron al Instituto Nacional de Perinatología (INPer) Isidro Espinosa de  los Reyes ubicado en la Ciudad de México, para cuidado prenatal, resolución del embarazo o atención de problemas ginecológicos, previo   consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Instituto con el número de protocolo: 212250-22761.  Todas las participantes respondieron un cuestionario acerca de aspectos socio-demográficos.

Muestras. A todas las mujeres se les tomaron dos  muestras de exudado cervical. La primera para el estudio de Papanicolaou y la segunda para la genotipificación de VPH. Ésta última se depositó en un vial que contenía medio de transporte Preserv-Cyt Solution (MA, USA) y se congeló a -20oC  hasta su procesamiento.

Genotipificación del VPH. Se empleó la prueba in vitro “Linear Array HPV Genotyping Test” (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) para la detección simultánea de hasta 37 genotipos virales, incluyendo trece de alto riesgo (VPH16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y veinticuatro de bajo riesgo (VPH6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70,71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39, CP6108).

De manera resumida el proceso de genotipificación se realizó de la siguiente forma:

1. Extracción y purificación del DNA empleando solución de lisis (con proteinasa K) y columnas de sepharosa.

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando iniciadores (PGMY) biotinilados específicos para el gen de la región L1 del genoma del  VPH e iniciadores específicos para el gen constitutivo de la p-globina, como control de calidad del DNA. La amplificación se realizó en un volumen  final de 100 μL, conteniendo 50 μL de la mezcla de reacción, 40 μL de agua y 10 μL del DNA purificado, según el siguiente protocolo: incubación  inicial a 50°C durante 2 minutos e incubación a 95° C durante 9 min, seguidas por 40 ciclos de amplificación (95°C/30 segundos, 55°C/1 minuto y  72°C/1 minuto) y una extensión final de 72°C durante 10 minutos. En cada corrida se incluyó un testigo negativo y otro positivo.

3. Hibridación. A  cada tubo con los productos de amplificación se le agregó solución desnaturalizante y se incubó una hora a 37°C. Posteriormente  esta mezcla se vertió sobre tiras de celulosa conteniendo DNA recombinante de cada uno de los 37 genotipos virales y se dejó interactuar durante  20 min/53°C.

4. Detección de los híbridos. Se realizó mediante revelado colorimétrico sobre las tiras de celulosa.

Análisis estadístico. Se empleó estadística descriptiva para los hallazgos socio-demográficos y para la genotipificación de VPH.

Resultados 

El promedio de edad de las mujeres analizadas fue de 28 ± 8,6 años, con un intervalo entre 15 y 46 años. La media de inicio de vida sexual activa fue de 19 ± 4,9 años, teniendo una mediana de 4 parejas sexuales. En la Tabla I se muestran el resto de variables socio-demográficas.

Tabla I. Variables socio-demográficas de 36 mujeres infectadas por el VPH

Se observó una mayor frecuencia de infección por VPH en mujeres con edad superior a los 20 (83%) años, que en mujeres que iniciaron su actividad sexual activa antes de los 20 (69%) años y las que tuvieron más de una (67%) pareja sexual antes del estudio (Figura 1).

Figura 1. Frecuencia de la infección por VPH (n=36) de acuerdo a las variables socio-demográficas.

Respecto a la genotipificación, en 36 pacientes se logró identificar al menos un genotipo de VPH, de tal manera que la frecuencia total de la  infección fue del 55,4%. Entre las pacientes infectadas se identificaron un total de 65 genotipos, de los cuales 19 (29,2%) fueron de alto riego y 46  (70,8%) de bajo riesgo.

Los genotipos de alto riego identificados con mayor frecuencia, fueron: VPH52 (11,1%) y 51 (8,3%), seguidos de VPH16, 31, 35 y 58 con el 5,6%  cada uno. Con relación a los genotipos de bajo riesgo, los más frecuentes fueron: VPH6 (44,4%), 53 (16,7%), 11 y 42 con el 11,1% cada uno (Tabla  II).

Tabla II. Distribución de genotipos de VPH más frecuentemente identificados de acuerdo a riesgo oncogénico.

Por otro lado, 14 (38,9%) mujeres presentaron infección con un solo genotipo, mientras que 22 (61,1%) pacientes estuvieron infectadas simultáneamente con al menos dos o hasta cuatro genotipos diferentes de VPH. El grupo de pacientes infectadas con dos genotipos (47,2%) fue el  de mayor predominio, seguido por el grupo de mujeres infectadas con un genotipo (Tabla III). No se identificó una hegemonía particular entre los  genotipos de VPH en las pacientes co-infectadas. En todos los casos la combinación de estos, fue específica para cada paciente (Tabla IV).

Tabla III. Proporción de mujeres con infección única y coinfección por diferentes genotipos de VPH

Con referencia al grupo de mujeres con infección por VPH, 23 (63,9%) se hallaban embarazadas, de ellas 21 (91,3%) se encontraban en el último  trimestre del embarazo, mientras que 2 (8,7%) pacientes cursaban el segundo trimestre. El resto (36,1%) no estaban embarazadas.

Tabla IV. Distribución de genotipos de VPH de alto y bajo riesgo por paciente identificados en casos de co-infección

En las mujeres que cursaban en su tercer trimestre de embarazo se identificaron un total de 39 genotipos de VPH; con presencia de un solo genotipo (9 casos) y  con hasta cuatro genotipos diferentes por paciente (12 casos). Este grupo mostró 13 genotipos de alto riesgo y 26 de bajo riesgo. Los genotipos de alto riesgo más frecuentes fueron: VPH31 en tres casos, VPH51 y 16 en dos casos, respectivamente; el resto VPH18, 35, 39, 52, 56 y 58 se identificaron en un solo caso, respectivamente. Por su parte, los genotipos de bajo riesgo más comunes fueron: VPH6 en diez casos, 53 en cuatro casos, 11, 42, 66 y CP6108 en dos casos cada uno y 40, 55, 61 y 84 en un solo caso respectivamente. Con respecto a las 2 pacientes con embarazo en el segundo trimestre, una de ellas presentó dos genotipos de alto riesgo (VPH35 y 52), mientras que en la otra paciente se  identificaron VPH6 y 55 que correspondieron a genotipos de bajo riesgo.

Finalmente, los resultados del estudio citológico indicaron que solamente 10/36 (27,8%) pacientes se diagnosticaron con lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG), el resto del grupo no mostró ningún otro tipo de lesión  epitelial. Un total de 19 (29,2%) genotipos fueron identificados en estas mujeres, de ellos 7 correspondieron a genotipos de alto grado (VPH52 y  VPH31 en dos casos; VPH35, VPH51 y VPH58 en un caso, respectivamente), mientras que 12 fueron de bajo riesgo (VPH6 en tres casos, VPH11 y  PH53 en dos casos, VPH42, VPH61, VPH66, VPH71 y VPH83 en un caso, respectivamente).

Discusión

La infección genital provocada por el VPH y la presencia de otros factores aumentan la probabilidad de desarrollar cáncer cervicouterino (4,6). La  prevalencia de la infección se incrementa notablemente dependiendo de la zona geográfica, la edad de las personas infectadas y la conducta sexual ( 1,9,10).

En este estudio, mostramos la distribución de diferentes genotipos de VPH identificados en pacientes que acudieron al INPer para su atención  gineco-obstétrica, ya sea de seguimiento o para resolución del embarazo, de tal manera que la frecuencia total fue del 55% con una distribución  heterogénea de los genotipos oncogénicos y no oncogénicos, acorde con los resultados obtenidos por diversos investigadores (1,9,11).

Con respecto al estudio sociodemográfico, la mayoría de las pacientes tuvo más de una pareja sexual, el inicio de su vida sexual activa fue antes de los 20 años y al momento del estudio las encuestadas mencionaron que no contaban con una pareja estable. En cuanto a su escolaridad, sobresalió que gran parte de ellas tenían menos de 9 años de estudio formal (Tabla I y Figura 1). En este caso, reportes de diversas investigaciones han encontrado una asociación entre las variables antes mencionadas con la adquisición de infección por VPH o el desarrollo de cáncer cervical (12-14). En este estudio  no se encontró ninguna relación significativa entre los aspectos sociodemográficos e infección por VPH.

Múltiples estudios han descrito la presencia de diversos genotipos en diferentes poblaciones de México. Colín- Orozco y cols (11) encontraron  frecuencias del 14,6 %, 8,2% y 7,9% para genotipos de alto riesgo VPH16, 18 y 58, mientras que los genotipos de bajo riesgo más frecuentes fueron VPH11 y 53. Por su parte, Lazcano-Ponce y cols (9), reportaron frecuencias iguales o menores al 2% para genotipos de alto riesgo VPH16,  31 y 18. En otro reporte, Peralta-Rodríguez y cols (15), en un meta-análisis identificaron VPH16, 58 y 18 como los genotipos más frecuentes en el  Oeste del país, para la región Central fueron los genotipos VPH16, 18 y 45, mientras que para la región Sur fueron VPH16, 18 y 31.

En este estudio, la mayoría de las pacientes seleccionadas provenían de la Ciudad de México y zonas conurbadas del Estado de México. Los tipos virales que más se repitieron en estas mujeres fueron, de alto riesgo VPH52, 51, 31, 35, 58, y 16, y de bajo riesgo VPH6, 53, 11 y 42. En los estudios descritos en el párrafo anterior, los autores emplearon PCR acoplado a secuenciación, o bien técnicas de arreglo en línea para 27 genotipos. Las diferencias en  los hallazgos de los diferentes genotipos pudiera ser el resultado de la diversidad en las técnicas de identificación empleadas, las cuales probablemente se enfocan en la detección de genotipos de alto riesgo, sin embargo también se debe considerar la homogeneidad en la toma de la  muestra. En este trabajo, empleamos una técnica de arreglo en línea similar al estudio anterior, pero con la diferencia que detecta hasta 37 genotipos. Observamos que los genotipos de alto riesgo VPH16 y VPH18 fueron detectados en menor frecuencia de lo esperado, sobresaliendo otros genotipos oncogénicos poco reportados en otros estudios (1,15-17).

Es claro que en la mayoría de los estudios existen coincidencias entre los genotipos identificados, sin embargo también existen diferencias en  cuanto al número de genotipos detectados y en cuanto a sus frecuencias, lo que confirma que la zona geográfica, la edad de las pacientes y la  metodología empleada son importantes en la distribución reportada del VPH (15-18).

Cabe destacar que dos terceras partes (61,1%) de las pacientes estudiadas mostraron co-infección con dos y hasta cuatro genotipos diferentes. La  mayoría de estas pacientes (59%) tenían combinaciones de genotipos de alto y bajo riesgo. Se ha sugerido que los genotipos de alto y bajo riesgo  oncogénico pudieran actuar sinérgicamente, de tal manera que se promueva fácilmente el desarrollo de cáncer cervical, a diferencia de aquellas  pacientes infectadas con un solo genotipo (19,20).

La elevada frecuencia de co-infección con genotipos de VPH de alto y bajo riesgo observada en  nuestro estudio, sugiere la necesidad de brindar seguimiento a estas mujeres en un futuro a mediano y largo plazo para detectar y prevenir futuras  complicaciones.

Por otro lado, se ha descrito una alta correlación entre la presencia de genotipos de alto riesgo y diferentes lesiones cervicales (4,15). Dos estudios  realizados en mujeres con lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG), con lesión intraepitelial de alto grado (LIEAG) o cáncer cervical, mostraron  frecuencias de infección por VPH del 56,4% al 99,1%, independiente del tipo de lesión (17,21). Sin embargo, entre ambos estudios, estas frecuencias variaron, principalmente con relación al genotipo de alto grado identificado; así para VPH58 el primer trabajó informó que el 28,5% de las  mujeres infectadas cursaba con algún tipo de lesión, contra solo el 0,7% de las informadas en el segundo estudio. Para el genotipo VPH16, el  primer estudio señaló la presencia de lesiones asociadas en el 25,7% de las mujeres, mientras que el segundo estudio se encontró esta asociación en el 53,4% de los casos estudiados.

En este trabajo, los genotipos de alto riego más frecuentes en las pacientes con LIEBG fueron, VPH52,  VPH31, VPH35, VPH51 y VPH58. Lo que concuerda con diferentes estudios con relación a la asociación que existe con la presencia de ciertos  virus oncogénicos y lesiones epiteliales (15,22).

Conclusiones

Se encontraron frecuencias de VPH16 y 18 por debajo de lo descrito por otros autores, sin embargo otros genotipos de alto riesgo fueron los más  comunes.

El 59% de las pacientes mostraron co-infección con diferentes genotipos de VPH y al menos un genotipo de alto riesgo estuvo presente en ellas. Considerando que la distribución de los diferentes tipos de VPH varían geográficamente y que los genotipos oncogénicos son más prevalentes en ciertas regiones, es importante contar con estudios basados en la población para evaluar el comportamiento de la infección, conocer el curso clínico de la enfermedad y definir la eficacia de las vacunas, de esta manera se ayudará a prevenir en parte el cáncer de cuello uterino.

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